Alexandra Benharkou hat im Rahmen des GENAU Summerschool Programmes vom 3. - 21.7. 2006 in unserem Labor gelernt, gearbeitet und geforscht. Sie kam mit einem guten Allgemeinwissen über Biologie, viel Neugierde und der Bereitschaft, alles zu lernen. Durch ihre höfliche und bescheidene Art war sie bald in der Gruppe integriert und von allen MitarbeiterInnen im Institut geschätzt.

In unserem Forschungslabor untersuchen wir die Entstehungsmechanismen der häufigsten Krebsart im Kindesalter - der akuten lymphatischen Leukämie. Die drei BetreuerInnen (zwei PhD StudentInnen und ein Post-Doc) denen Alexandra während ihrer Zeit im Labor zugeteilt war, bearbeiten unterschiedliche Aspekte dieses Forschungsbereichs, sodass ein großer Überblick - soweit in dieser begrenzten Zeit möglich - geboten wurde. Alexandra hat diese Herausforderung angenommen und hervorragend gemeistert. Sie war in ihrer Arbeit selbständig, las viel, hat aber auch, wann immer die Möglichkeit vorhanden war und es die Zeit erlaubte, Fragen gestellt. Sie verfolgte die Forschungsarbeit der anderen genau und hat selbst ihre Experimente parallel dazu durchgeführt. Dabei zeigte sie viel Geschick. So hat sie, unter anderem, folgende Methoden gesehen und durchgeführt: Separation von Zellen mit Dichtegradienten, Zellkulturen, RNA Isolierung, Plasmidpräparationen, Restriktionsverdaue und Auftrennung der Fragmente auf Agarosegelen, Proteinanalysen mit Western Blot und Druchflusszytometrie. Alexandra hat die Möglichkeit, in einem Forschungslabor zu lernen, mit großer Begeisterung genutzt.

Wir wünschen Alexandra alles Gute und viel Erfolg in ihrer zukünftigen Arbeit und sind sicher, dass sie in jedem anderen Labor, aber auch an einer anderen Arbeitsstelle, eine wertvolle und zur Zusammenarbeit fähige, und sehr geschätzte Mitarbeiterin sein wird.

Und wieder war ich vor 8 Uhr im Labor, als erste und hab schon mal begonnen die Glasplatten usw. für die Gelelektrophorese (für den Western-Blot) vorzubereiten. Dann kam auch schon mein Betreuer Gerd, ganz pünktlich um 8 Uhr. Ich habe anschließend gleich das Seperating -und Stackinggel hergestellt. Den Western-Blot kann ich schon beinahe auswendig und das gefällt mir:)!

Während der Zeit, in der das Gel auspolymerisierte, haben Gerd und ich die Proteinkonzentration der einzelnen Proben gemessen um zu wissen, von welcher Probe mehr und von welcher weniger in das Gel geladen werden muss.
Dazu werden 500µl PBS, 1µl Proteinextrakt und 100µ Bradford in eine Küvette gegeben und am Fotometer gemessen.

Wie der Western-Blot weiter funktioniert habe ich bereits beschrieben, wie gesagt, nichts Neues.

Danach mussten wir wieder FACS machen. Dafür habe ich in insgesamt 96 FACS-Röhrchen Zellen von vier Platten und dann noch PI (Propidiumjodid)hineinpipettiert. PI verwendet man zum Färben der toten Zellen, da die Membran der toten Zellen kaputt ist und das PI nur dann in die Zelle gelangt und sie einfärbt. Das waren insgesamt also 192 Pipettierschritte, es hat zwar Spaß gemacht, aber man muss sich dabei irsinnig konzentrieren, um Fehler zu vermeiden. Die Proben wurden dann am FACS Gerät gemessen. Die Auswertung erfolgt morgen.

Zum Schluss habe ich noch Eva bei der Routine geholfen. Wie gestern wurde eine Ficoll-Seperation durchgeführt.
Soviel zum heutigen Tag.

Bisher sah ich im Labor nur irgendwelche durchsichtigen Flüssigkeiten mit DNA, Proteinen usw, aber heute habe ich Eva, eine weitere Laborantin in Labor 5, bei der Routine (nicht nur) zusehen dürfen. Sie hat Knochenmarkproben von der Klinik geholt. Das macht sie eigentlich fast jeden Tag, aber bisher habe ich ihr bei der Routine noch nie zugeschaut. Das war eben etwas ganz anderes, echtes Knochenmark zu sehen, als nur irgendwelche glasrigen Lösungen. Knochenmark habe ich mir aus welchen Gründen auch immer, etwas anders vorgestellt. Im Prinzip sieht es aber genauso aus, wie normales Blut. Der Unterschied zum Knochenmark ist nur, dass man im peripheren Blut keine Stammzellen findet. Es gibt auch den Fall, dass z.B. bei einem leukämiekranken Kind die Leukämiezellen nur im Knochenmark zu finden sind.

Eva und ich haben mit dem Knochenmark eine Ficoll-Seperation durchgeführt. Ficoll ist ein wasserlösliches Polysaccharid, welches Blut in seine Bestandteile (Erythrozyten, Leukozyten etc.) auftrennen kann. Wir haben 5 ml Ficoll in ein Falcon gegeben und die Flüssigkeit langsam mit Knochenmark überschichtet. Das Fläschchen wurde dann in eine Zentrifuge gestellt, damit das Blut in seine Bestandteile aufgetrennt wird. Am Boden des Falcons setzten sich die Erythrozyten (rote BK) ab, darüber befand sich das Ficoll und das Blutplasma. Zwischen Ficoll und Plasma konnte man einen weißlichen Ring, den MNC-Ring (MonoNuclearCell), erkennen, welcher die Leukozyten (weiße BK) darstellt. Dieser musste vorsichtig mit einer sterilen Pasteurpipette aufgenommen und in ein neues Falcon übergeführt werden. Die Leukozyten im neuen Falcon haben wir mit einer PBS Lösung gereinigt und wieder zentrifugiert. Der Überstand wurde danach wieder abgehoben, die weißen BK wurden mit 1 ml RPMI Medium resuspendiert, am Counter gezählt und mit DMSO weggefriert.

Für mich war das etwas völlig Unbekanntes und deshalb wahrscheinlich sehr aufregend und spannend.

Ansonsten habe noch ein Gel geladen, Zellen gesplittet usw., das übliche eben.

Morgen mache ich wieder u.a. einen Western-Blot und FACS. Den Western-Blot kann ich beinahe ohne Hilfe:)! In den ersten Tagen im Labor war ich ein bisschen verzweifelt, weil ich noch keine Methode kannte und nicht wusste wie, was, aber mittlerweile macht es mir so richtig Spaß!
Bis morgen!

Meine allerletzte Woche hat begonnen und irgendwie macht mich das ein bisschen wehmütig. Bis jetzt hat es mir hier im Labor mit diesen Leuten sehr viel Spaß gemacht. Es ist einfach interessant das alles, was ich in Biologie teilweise gehört und gelernt habe, in der Praxis mitzuerleben und selbst durchzuführen. Wie wir in der Schule das Thema Molekularbiologie durchgenommen haben, hörte ich Wörter wie Molekülschere (Restriktionsenzym), Molekülkleber (Ligase), Plasmidringe, usw.. und ich hab mir nie wirklich vorstellen können, wie das im richtigen Leben funktioniert, wie z.B. die Molekülschere schneidet, was man dabei genau macht usw. und mittlerweile habe ICH SELBST einen Plasmidring mit dem Restriktionsenzym "aufgeschnitten", irgendwie lustig. Ich bin froh, dass ich diese Erfahrungen machen darf.

Heute war ich wieder einmal sehr früh im Labor. Ich war sozusagen die erste. Da ich schon wusste, dass wir einen Western-Blot machen werden, habe gleich als erstes die Glasplatten mit 70%igem Ethanol gereinigt und die Vorrichtung für das Gelgießen zusammengebaut. Kurz darauf war meine Betreuerin Andrea auch schon da. Anschließend habe ich das Gel hergestellt und eingegossen, die Proben (Proteinextrakt) wurden mit einem Marker blau eingefärbt und in die Slots eingefüllt, Strom wurde angesteckt und die Proteine konnten durch das Gel wandern. Danach bereitete ich den Transfer der Proteine auf die Nitorzellulosemembran vor. Es verlief alles reibungslos. Die weiteren Schritte werde ich nicht mehr beschreiben, da ich bereits einen halben Roman über den Western-blot gepostet habe:)!

Kurz vor der Mittagspause habe ich noch Zellen (Zelllinie UT-7) gesplittet. Dieser Vorgang erfolgt in einer Sterilbank oder auch Laminar Flow genannt. Eine Zellkultur wird gesplittet, damit man verhindert, dass sie zu dicht werden und absterben und um sie weiterhin mit Nährstoffen zu versorgen. Meine Betreuerin arbeitet generell mit Suspensionszellen. Das sind Zellen, die nicht am Flaschenboden haften, sondern frei im Nährmedium schwimmen. Das Zellensplitten ist im Prinzip ganz einfach. Man nimmt die Flasche mit den bereits dicht angewachsenen Zellen und dem verbrauchten Medium, entnimmt einen Teil der Flüssigkeit und verwirft diesen. Dann gibt man frisches Nährmedium stellt die Zellen wieder in den Inkubator. Wenn das Absterben der Zellen bereits sehr weit fortgeschritten ist, gießt man die Zellen mit dem alten Medium in ein Falcon um und zentrifugiert die Zellen ab. Danach kann der Überstand leicht abgehoben werden, übrig bleiben die Zellen, die man dann mit frischem Nährmedium neu "füttert".

Am 9.Tag lief nicht alles so ganz nach Plan. Meine Betreuerin Andrea wurde plötzlich krank, d.h. Gerd, das ist auch einer aus dem Labor 5, hat mich gestern übernommen.
Ich habe eine Menge pipettieren müssen und war rund um die Uhr beschäftigt. Das war echt ein super Tag!
Gestern habe ich zum ersten mal das Facsen probiert. Der Name FACS ist eigentlich irreführend, da meist keine Sortierung vorgenommen wird, sondern nur eine Messung der Eigenschaften von Zellen. Die allgemeine Bezeichnung des Verfahrens lautet Durchflusszytometrie.
Grundsätzlich beruht das Prinzip der Untersuchung auf der Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen Laserstrahl passiert.

Die Zellen, die sich in einer Lösung befindet, werden durch eine Kapillare gesaugt und passieren einen Laserstrahl. Die Zelle emittiert dabei Streulicht und, wenn Antikörper gebunden sind, Fluoreszenzimpulse, woraus man unterschiedliche Eigenschaften der Zelle ableiten kann.

Das Streulicht wird durch Zellgröße, die Struktur der Zellwand sowie intrazelluläre Bestandteile beeinflusst.
Die Zellen können damit in unterschiedliche Fraktionen sortiert und gezählt werden.

Es gibt das Vorwärtsstreulicht FSC (Forward Scatter) als Maß für die Zellgröße und Seitwärtsstreulicht SSC (Side Scatter) als Maß für die Granularität (Größe und Struktur des Zellkerns etc.). Mit diesen beiden Parametern lassen sich zum Beispiel die Zellen des Blutes bereits recht gut auftrennen.

Mein gestriger Betreuer Gerd hat den Zellen unterschiedlich hohe Dosen von Medikamenten, die auch zur Krebsbehandlung eingesetzt werden, beigegeben. Anhand des FACS konnte man dann sehen, wieviele Zellen dadurch abgestorben und wieviele überlebt haben. Die Daten wurden in Excel-Sheet übertragen und anhand eines Diagrammes dargestellt.

Am Ende des Tages durfte ich noch Zellen splitten.

Heute ist meine Betreuerin Andrea wieder da, wir werden an den PCRs weiterarbeiten.