Nachdem ich gestern wieder DNA isoliert habe, lernte ich heute eine neue Art der PCR, die Insertions – PCR. Abgesehen von den Primern (=Ansatzstellen für die DNA-Vervielfältigung) ändert sich an der Arbeit allerdings nichts. Mit dieser PCR haben wir den Genotyp des Gens nrpd1B der Pflanzen untersucht. Dazu müssen mit jeder isolierten DNA zwei PCR´s mit verschiedenen Primern durchgeführt werden.
Eine PCR funktioniert folgendermaßen:
Zu der isolierten DNA werden ein Puffer (10xPCR Puffer), dNTP, zwei Primer, eine Taq-Polymerase (Enzym, welches auch bei der DNA- Replikation eine wichtige Rolle spielt) und Wasser hinzugefügt. Anschließend werden die Proben in eine PCR-Maschine gestellt, darin wird laufend die Temperatur verändert, wodurch sich ein bestimmter Teil der DNA immer wieder verdoppelt. Dadurch erhält man innerhalb kurzer Zeit so viel DNA, dass der gewünschte Bereich sichtbar wird. Danach wird zu jeder PCR-Probe ein Tropfen eines Marker dazugegeben und in ein Agarosegel gefüllt. Durch Elektrophorese wir die DNA der Größe nach aufgespaltet (die DNA ist negativ elektrisch geladen und wird daher bei angelegter Spannung an den Pluspol gezogen). Danach kann das Ergebnis in einem „Gel-Dokumentationsgerät“ (mit UV-Licht) betrachtet werden. Was das Ergebnis aussagt, hängt von den Primern ab:
Primer 1 kann nur ansetzen (und den DNA-Abschnitt vervielfältigen), wenn KEINE Insertion vorhanden ist. Das bedeutet, dass bei Wildtyp-Pflanzen (also Pflanzen ohne genetische Veränderung) eine Signal (in Form eines Balkens) zu sehen sein muss. Bei heterozygoten Pflanzen ebenfalls, da sie nur auf einem Chromosom die genetische Veränderung tragen, kein Signal ist allerdings bei homozygoten Pflanzen sichtbar, da bei diese auf beiden Chromosomen genetische Mutationen vorliegen.
Primer 2 funktioniert genau gegengleich, er kann nur ansetzen, wenn eine Insertion vorhanden ist: Bei Wildtyp (WT) kein Signal, bei heterozygoten und homozygoten Pflanzen ein Signal.

Aus der Kombination dieser beiden Ergebnisse kann somit der Genotyp einer Pflanze bestimmt werden. Würde nur eine PCR gemacht werden, könnten beispielsweise nur homozygote Pflanzen erkannt werden, denn sowohl WT, als auch heterozygote Pflanzen würden ein Signal zeigen.

Ich hoffe könnt das zumindest halbwegs verstehen, sonst könnt ihr mich gerne fragen!

Lg Alex

Meine erste PCR (Polymerase-chain-reaction) stand heute auf dem Programm! Also wie man innerhalb kürzester Zeit aus wenig DNA viel DNA macht (dies ist nötig, damit der gewünschte Abschnitt der DNA sichtbar wird).
Für die PCR verwendete ich die DNA, welche ich gestern isoliert habe, musste einen Puffer herstellen und diesen zusammen mit zwei Primern (Enzyme welche auch bei der DNA-Replikation beteiligt sind) und einem kleinen Tropfen Mineralöl (damit nichts verdampft) hinzufügen, die „Eppis“ (=Eppendorf Tubes) mit diesem Gemenge für rund 3h in der PCR-Maschine lassen (darin werden die Tubes in bestimmten Abständen auf die gewünschten Temperaturen erhitzt damit sich der gewünschte DNA-Abschnitt vervielfacht; dieser Vorgang ist der „normalen“ DNA-Replikation sehr ähnlich).
Um tatsächlich die Marke zu sehen musste ich aber noch ein Agarosegel herstellen und eine Elektrophorese durchführen. Dann war es aber wirklich geschafft und in hatte mein Ergebnis in den Händen! Glücklicherweise hat sogar alles funktioniert und ich konnte tatsächlich etwas sehen, denn normalerweise gehen die ersten Versuche oft daneben.

Das Hitzestressexperiment wurde auch weitergeführt. Dazu musste ich wiederum, wie schon die letzten zwei Tage, eine Platte, welche am Montag 3h mit 37°C behandelt wurde, für 1h in den Wärmeschrank stellen (45°C).


Lg Alex

Das Hitztstressexperiment läuft über mehrere Tage oder Wochen. Nachdem 6 von den 9 Platten bereits am Montag 3h mit 37°C behandelt wurden, wird nun drei Tage lang jeweils eine Platte für 1h mit 45°C behandelt, um zu untersuchen, ob es einen Unterschied macht, wann man die Pflanzen stresst.
Eine Platte, welche am Montag behandelt wurde, musste ich heute einfrieren, davon wird dann eine Genexpressionsanalyse gemacht. Die Genexpression ändert sich allerdings sehr rasch (die Pflanzen reagieren schnell auf Veränderungen), deshalb werden die Proben sofort schockgefroren, damit genau die Genexpression zum gewünschten Zeitpunkt X analysieren zu kann. Bei -80°C stoppt sofort der Stoffwechsel der Pflanze, daher ändert sich auch die Genexpression nicht mehr.

Hier findest du Platz für deine Forschungsdokumentation.

Hier findest du Platz für deine Forschungsdokumentation.

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Nach dem Wochenende stand heute für mich ein arbeitsreicher Tag bevor.
Ich durfte von den GFP-Linien (mit diesen habe ich auch bereits die ersten Tage gearbeitet, das sind Pflanzen mit bestimmten Mutationen) jeweils 5 Pflänzchen auf eine Transferschale übertragen (diese muss ich morgen dann auf Erde setzten), dies muss unter sterilen Bedingungen ablaufen (unter der "Lamin Air") damit sich keine Pilze in den Platten einnisten, welche die Pflänzchen kontaminieren würden. Weitere 5 Pflänzchen je Linie musste ich noch einfrieren (zuerst in flüssigem Stickstoff schockfrieren und dann in einen Eiskasten mit -80°C legen) und den Rest mit Hitze behandeln.
Heute begann auch das Hitzeexperiment. Für dieses Experiment gibt es 9 idente Platten mit 12 verschiedenen Arabidopsis Pflanzen (sowohl Wildtyp als auch Mutanten), diese Pflanzen werden gestresst, also in einen Wärmeschrank gelegt und die Auswirkungen verglichen (sind bestimmte Mutanten möglicherweise resistenter?). Zuerst wurden 6 Platten drei Stunden mit 37°C behandelt, danach wieder auf "Normaltemperatur" (~ 22°C) gebracht. Eine Platte wurde allerdings sofort eingefroren (zusammen mit einer Kontrollplatte ohne jegliche Behandlung), damit wird in einigen Tagen eine RNA-Analyse durchgeführt.
Nach zwei Stunden "Erholung" wurde eine zuvor gestresste Platte eine Stunde lang mit 45°C behandelt und auch eine bisher unbehandelte Platte wurde 1h auf 45°C erwärmt.
Damit dabei auch wirklich alles nach Plan läuft, also die Zeitangaben eingehalten werden und nichts vergessen wird, musste zuerst ein kleiner Zeitpaln erstellt werden!

So, nun habe ich aber wirklich genug geschrieben!

lg Alex




Am Freitag lernte ich „Pflanzen ausplattieren“. Unsere Arabidopsis thaliana Pflanzen wachsen nicht von Beginn an auf Erde, sonder keimen völlig steril, in verschlossenen Platten, auf einem Medium namens Agar (das kennt man auch aus der Küche!!!!;-) Dieses Medium enthaltet Stärke (Zucker), Wasser und Mineralstoff, also alles was die Pflanzen brauchen um wachsen zu können, deshalb wachsen sie bei uns auch schneller und sind „stärker“ (widerstandsfähiger, je nach dem, wie viel Stärke man hinzufügt) als in der Natur.
Bevor die Samen auf die Platten gelegt werden (mittels Einwegpipetten), müssen sie steril gemacht werden (mittels Chemikalien). Diese Arbeit hört sich zwar nicht sehr schwierig an, erfordert allerdings sehr viel Geduld, hunderte Samen einzeln und mit einer Pipette auf den Agar legen!
Außerdem habe ich heute die erste Messung des UV-B Experiments durchgeführt. Nachdem wir am 29.07.09 die UV-B Behandlung gestartet haben mussten heute (10 days UV-B Stress) die Rosettendurchmesser (Durchmesser der untersten Blätter) aller Pflanzen (sind ca. 400) gemessen und aufgeschrieben werden, sowie Fotos gemacht werden. Zwei weitere solche Messungen werden in der kommenden Woche folgen und die Ergebnisse anschließend verglichen.
So funktioniert das UV-B Experiment: Es gibt 21 Überexpressionslinien, also 21 verschiedene Pflanzenlinien (4 Töpfe zu jeweils 5 Pflanzen pro Linie, diese habe ich als einer meiner ersten Arbeiten im Labor selbst auf Erde gesetzt), welche so transformiert wurden, dass jeweils ein bestimmtes Gen überexprimiert (=vermehr produziert) wird. Von diesen 4 Töpfen fungieren jeweils 2 als Kontrolltöpfe, sie werden nicht mit UV-B behandelt.
In dem UV-B Schrank gibt es zwei Regale, oben mit UV-B Strahlung und unten die gleichen Licht- und Temperaturverhältnisse nur ohne UV-B (für die Kontrolltöpfe). Alle Töpfe bleiben von Beginn bis zum Ende in diesem Schrank, das Licht wird dem Tag- Nachtrhythmus angepasst.