Methoden / Experimente
14:08 / 18.06.2010
5.7.2010:Lassen wir uns überraschen! Bis jetzt hab ich erst Erde eingewogen. Also, zum mitschreiben:
- ungefähr 0,5g Bodenprobe in Beadbeat- Küvetten gen-au einwägen
6.7.2010: Heute wurde DNA aus den Erdproben extrahiert und gereinigt. Dafür wurde ein vorgefertigtes Protokoll verwendet, welches ein optimiertes Verfahren eines DNA- Extraktionskits beinhaltet.
Die DNA wurde mithilfe von Natriumsulfatpuffer, SDS- hältigem MT Puffer und einer Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol Mischung durch beadbeating (ein Verfahren bei dem zie Zellwände mechanisch über Glasperlen aufgebrochen werden)aus der Probe extrahiert. Die Erde wurde abzentrifugiert, der Überstand wurde gesammelt und der Schritt wiederholt.
Anschließend wurde PPS Lösung zugesetzt, um die Proteine zu fällen, welche wieder abzentrifugiert wurden. Die nächsten Schritte führte Stefan durch, da wir auf einer Sicherheitsunterweisung waren.
Nach der rückkehr ins vertraute Labor testeten wir die DNA mithilfe einer UV- Spektroskopie auf ihre Reinheit. Um sie von störenden Huminsäuren zu befreien, bauten wir sie in ein Agarose-Plug ein. Diesen stellten wir her, indem wir eine LMP Agarose- Lösung herstellten und diese in einem kleinen Behältnis mit der DNA vermischten. Bis zu meinem Arbetstagsende war die Agarose noch nicht ausggehärtet, aber Stefan hat voraussichtlich den fertigen Plug schon in Puffer eingelegt, damit die Huminsäuren herausdiffundieren können.
Morgen werden wir wahrscheinlich zum ersten mal eine Probe Spiken, Ich glaube mit den Bakterien von Jennifer, ich bin mir aber nicht sicher. Übrigens, schaut euch auch Jennifers Blog(http://www.summerschool.at/jennifer.hutterer/) an, die macht auch viel Interessantes im Labor!!
7.7.2010: Ich hab mich geirrt, es waren nicht Jennifers Bakterien, aber die, die zum spiken verwendet werden sollten hatten eine zu geringe optische Dichte (hängt mit der Konzentration zusammen) und deshalb werden wir am Montag neue ansetzen. Heute wurde der Plug mit der DNA eingeschmolzen und verdünnt, sodass die Lösung auf Eis flüssig bleibt. Danach wurde wieder eine Qualitätskontrolle mit dem UV Spektrometer durchgeführt, diesmal war alles bestens, weil keine störenden Huminsäuren dabeiwaren. Wir gossen ein Agarose Gel, welches mit dem UV-fluoreszierendem DNA- Farbstoff Ethidiumbromid versetzt war. Um die Länge der DNA- Fragmente zu ermitteln, führten wir eine Elektrophorese durch. Dafür versetzten wir die DNA mit einem Farbstoff, pipettierten sie in die Kammern des Gels und ließen einen Marker mitlaufen, der Banden bei speziellen DNA- Längen hatte. Unsere DNA hatte genau die richtige Anzahl an Basenpaaren für eine PCR, was auch schon das Stichwort für die weitere Arbeit war. Ein Mastermix wurde hergestellt. Dieser bestand aus Wasser(bidestilliert und UV behandelt), 10x Puffer, NTPs, einem front Primer, einem reverse Primer, DNA Polymerase und zum Schluss kam die DNA dazu. Das PCR- Programm wurde gestartet und heute Nacht baut das Enzym ganz viele Kopien unseres geliebten Gens! OH YEAH!
8.7.2010: Heute wurde eine Elektrophorese mit dem Gen, das bei der PCR kopiert wurde, durchgeführt, einem Gen, aus welchem ribosomale RNA transkribiert wird. Weiters wurde aus einer weiteren Probenreihe DNA extrahiert, diesmal konnte ich auch die Schritte durchführen, bei denen ich das letzte Mal bei der Sicherheitsunterweisung war. Diese waren folgende: Nach der Proteinfällung wurde der Überstand mit einer DNA bindenden Matrix versetzt. Diese Mischung wurde in bestimmten Filter- Säulen zentrifugiert, sodass die Matrix, in der die DNA gebunden ist im Filter hängen bleibt, während der flüssige Rest entsorgt werden kann. Die Matrix wurde mit Ethanol haltiger SEWS- Lösung gewaschen, welche danach abzentrifugiert wurde. Die Matrix wurde in Wasser suspendiert und und bei 55°C inkubiert. Nun war die DNA im Wasser gelöst und der Filter konnte weggeworfen werden. Die Plugs werden am Montag gegossen.
12.7.2010. JUHU!!! Heute wurden endlich die Spike- Bakterien angesetzt. Diese enthalten ein bestimmtes Gen, welches sie einen blauen Farbstoff produzieren lässt. Dafür brauchen sie jedoch einen bestimmten Nährstoff, den wir ihnen jedoch vorenthalten, weil er teuer ist und uns die blaue Farbe sowieso nicht interessiert, denn wir haben Primer für das Gen und mit denen machen wir später quantitative PCR und außerdem machen wir eine OD- Messung als Bonus sozusagen. Damit es die Bakterien auch gemütlich haben und brav wachsen, wurde jeweils eine Koloie in 5 mL Nährlösung geimpft, welche Jennifer schom letzte Woche hergestellt hat (http://www.summerschool.at/jennifer.hutterer) und in einen Schwenker bei 28°C gestellt.
Für die bereits herausextrahierte DNA wurden Plugs nach dem gleichen Verfahren gegossen.
Für die Probenbakterien wurden Nehrböden hergestellt. Dazu wurden 4g NaCl, 4g Hefe, 8g Trypton und 15g Agar Agar mit dest. Wasser aufgefüllt und 20 min autoklaviert. Dieser wurde dann in Petrischalen gegossen und aushärten lassen.
- ungefähr 0,5g Bodenprobe in Beadbeat- Küvetten gen-au einwägen
6.7.2010: Heute wurde DNA aus den Erdproben extrahiert und gereinigt. Dafür wurde ein vorgefertigtes Protokoll verwendet, welches ein optimiertes Verfahren eines DNA- Extraktionskits beinhaltet.
Die DNA wurde mithilfe von Natriumsulfatpuffer, SDS- hältigem MT Puffer und einer Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol Mischung durch beadbeating (ein Verfahren bei dem zie Zellwände mechanisch über Glasperlen aufgebrochen werden)aus der Probe extrahiert. Die Erde wurde abzentrifugiert, der Überstand wurde gesammelt und der Schritt wiederholt.
Anschließend wurde PPS Lösung zugesetzt, um die Proteine zu fällen, welche wieder abzentrifugiert wurden. Die nächsten Schritte führte Stefan durch, da wir auf einer Sicherheitsunterweisung waren.
Nach der rückkehr ins vertraute Labor testeten wir die DNA mithilfe einer UV- Spektroskopie auf ihre Reinheit. Um sie von störenden Huminsäuren zu befreien, bauten wir sie in ein Agarose-Plug ein. Diesen stellten wir her, indem wir eine LMP Agarose- Lösung herstellten und diese in einem kleinen Behältnis mit der DNA vermischten. Bis zu meinem Arbetstagsende war die Agarose noch nicht ausggehärtet, aber Stefan hat voraussichtlich den fertigen Plug schon in Puffer eingelegt, damit die Huminsäuren herausdiffundieren können.
Morgen werden wir wahrscheinlich zum ersten mal eine Probe Spiken, Ich glaube mit den Bakterien von Jennifer, ich bin mir aber nicht sicher. Übrigens, schaut euch auch Jennifers Blog(http://www.summerschool.at/jennifer.hutterer/) an, die macht auch viel Interessantes im Labor!!
7.7.2010: Ich hab mich geirrt, es waren nicht Jennifers Bakterien, aber die, die zum spiken verwendet werden sollten hatten eine zu geringe optische Dichte (hängt mit der Konzentration zusammen) und deshalb werden wir am Montag neue ansetzen. Heute wurde der Plug mit der DNA eingeschmolzen und verdünnt, sodass die Lösung auf Eis flüssig bleibt. Danach wurde wieder eine Qualitätskontrolle mit dem UV Spektrometer durchgeführt, diesmal war alles bestens, weil keine störenden Huminsäuren dabeiwaren. Wir gossen ein Agarose Gel, welches mit dem UV-fluoreszierendem DNA- Farbstoff Ethidiumbromid versetzt war. Um die Länge der DNA- Fragmente zu ermitteln, führten wir eine Elektrophorese durch. Dafür versetzten wir die DNA mit einem Farbstoff, pipettierten sie in die Kammern des Gels und ließen einen Marker mitlaufen, der Banden bei speziellen DNA- Längen hatte. Unsere DNA hatte genau die richtige Anzahl an Basenpaaren für eine PCR, was auch schon das Stichwort für die weitere Arbeit war. Ein Mastermix wurde hergestellt. Dieser bestand aus Wasser(bidestilliert und UV behandelt), 10x Puffer, NTPs, einem front Primer, einem reverse Primer, DNA Polymerase und zum Schluss kam die DNA dazu. Das PCR- Programm wurde gestartet und heute Nacht baut das Enzym ganz viele Kopien unseres geliebten Gens! OH YEAH!
8.7.2010: Heute wurde eine Elektrophorese mit dem Gen, das bei der PCR kopiert wurde, durchgeführt, einem Gen, aus welchem ribosomale RNA transkribiert wird. Weiters wurde aus einer weiteren Probenreihe DNA extrahiert, diesmal konnte ich auch die Schritte durchführen, bei denen ich das letzte Mal bei der Sicherheitsunterweisung war. Diese waren folgende: Nach der Proteinfällung wurde der Überstand mit einer DNA bindenden Matrix versetzt. Diese Mischung wurde in bestimmten Filter- Säulen zentrifugiert, sodass die Matrix, in der die DNA gebunden ist im Filter hängen bleibt, während der flüssige Rest entsorgt werden kann. Die Matrix wurde mit Ethanol haltiger SEWS- Lösung gewaschen, welche danach abzentrifugiert wurde. Die Matrix wurde in Wasser suspendiert und und bei 55°C inkubiert. Nun war die DNA im Wasser gelöst und der Filter konnte weggeworfen werden. Die Plugs werden am Montag gegossen.
12.7.2010. JUHU!!! Heute wurden endlich die Spike- Bakterien angesetzt. Diese enthalten ein bestimmtes Gen, welches sie einen blauen Farbstoff produzieren lässt. Dafür brauchen sie jedoch einen bestimmten Nährstoff, den wir ihnen jedoch vorenthalten, weil er teuer ist und uns die blaue Farbe sowieso nicht interessiert, denn wir haben Primer für das Gen und mit denen machen wir später quantitative PCR und außerdem machen wir eine OD- Messung als Bonus sozusagen. Damit es die Bakterien auch gemütlich haben und brav wachsen, wurde jeweils eine Koloie in 5 mL Nährlösung geimpft, welche Jennifer schom letzte Woche hergestellt hat (http://www.summerschool.at/jennifer.hutterer) und in einen Schwenker bei 28°C gestellt.
Für die bereits herausextrahierte DNA wurden Plugs nach dem gleichen Verfahren gegossen.
Für die Probenbakterien wurden Nehrböden hergestellt. Dazu wurden 4g NaCl, 4g Hefe, 8g Trypton und 15g Agar Agar mit dest. Wasser aufgefüllt und 20 min autoklaviert. Dieser wurde dann in Petrischalen gegossen und aushärten lassen.
