1.Schritt) GESCHLECHTSBESTIMMUNG FÖTALER GEWEBSPROBEN AUS INTERRUPTIONSMATERIAL:

13. 8. 2009
PCR:
DNA liegt in Doppelhelix vor. Vorbereitete DNA erhitzt auf 96°C, damit sie denaturiert und zu zwei Einzelstränegn zerfällt. Anschließende Temeratursenkung auf ca. 62°C führt dazu, dass der forward Primer (quasi ein künstlicher Teil der DNA, mit einer genau eingestellten Sequenz) am unteren Strang der DNA hybridisiert. Um nun eine Vervollständigung des Strangeszu erhalten gibt man eine Polymerase hinzu, Dabei wird DNA Mixtur auf 72°C erhitzt um das zu bewerkstelligen. Vorgang wird wiederholt damit der reverse Primer genau das gleiche am unteren Einzelstrang vollziehen kann. Diese ganze Prozedur wird so lange durchgeführt, bis der gewünschte Bereich, den man untersuchen will, an den auch die Primer gebunden sind und der ausschlaggebend ist zur Bestimmung ob nun ein weibliches oder männliches Gewebe vorliegt, sehr stark vermehrt vorliegt.

VORGANG:

1) Probenaufarbeitung

•Fingergroßes Stück Gewebe > SSW 9, Tag 4 > Dezidua, Villi
•Vorbereitung der Medimachine („Fleischwolf“) > Rührgefäß mit 1 ml PBS 2 mal spülen und wieder absaugen > gebrauchtes PBS zur Entsorgung in extra Gefäß geben
•Gewebe (in 2 getrennten Eppis befindlich) > in Rührgefäß geben (zuerst Dezidua, dann Villi, also 2 getrennte Vorgänge durchführen) > in Medimachine > ca. 30’’ einschalten > schauen ob Gewebe vollständig zerkleinert
•Jeweiliges Gewebe in Eppi überführen > Endvolumen ca. 1 ml Zellsuspension in PBS
•Beschriftung zur Identifikation


2) Isolation der DNA

•20 µl der Zellsuspension (zerkleinerte Gewebe) > zu 200 µl InstaGene Matrix (BIO-RAD, # 732-6030)
•Eppis mit Zellsuspension 30’ bei 56°C auf Heizblock
•10’’ vortexen (2500-1) > DNA Cocktail mischen
•8’ in kochendes Wasser (mit Schwimmer)
•10’’ vortexen (2500-1) > Zellen endgültig aufgebrochen
•2’ 12000 upm (Zentrifuge) > im Gel und Zellbruchstücke zu Gefäßboden zentrifugieren
• > im Überstand befindet sich nun DNA
•Überstand (isolierte DNA) > Gleichgebrauch bei 2°C-8°C lagern > sonst bei -20°C einfrieren


3) PCR

DNA-Lösungen (Proben isolierte Villi, Dezidua)
1x Positivkontrolle (männliche DNA)
1x Negativkontrolle (desionisiertes H2O)

6x Probe 7x 1x

DNA 8 µl
Primer (forward) 1 µl
Primer (reverse) 1 µl
2x HotStarTag Master Mix 10 µl

Probe Nr. 1 2 3 4 5 6
Probenart DNA (Dezidua) DNA (Dezidua) DNA (Villi) DNA (Ville) H2O Männl. DNA-Lsg
Bemerkung 8 µl 8 µl 8 µl 8 µl neg.Kontrolle pos.Kontrolle


•PCR-Programm

15’ 94°C
30’’ 94°C
1’ 60°C
1’ 72°C
7’ 72°C
∞ 8°C

4) Gel
mittels Agarose und TAE-Puffer Gel herstellen > in Kammer gießen > Kamm hineinstecken > fest werden lassen > DNA-Lösung in die Kammern wo sich davor der Kamm befunden hat > 100 V eine 1/2 Stunde warten

Das Gel dient zur genauen Bestimmung, ob eine GEwebsprobe männlich oder weiblich ist. Da beide eine unterschiedlich lange Nukleotidreihe besitzen, wandert die kürzere Bande logischerweise auf Grund der geringeren Größe schneller durchs Gel.

Leider kein brauchbares Ergebnis zu vermerken, da die DNA-Lösung vermutlich verschmutzt war.

14. 8. 2009
Gewebe aus der 9. SSW + 1 Tag > BIP 8104 > gestern schockgefrorenin flüssigem Stickstoff um es haltbar zu machen
heute in PSB (Bufferlösung) aufgetaut und anschließend zerkleinert
weiterer Verlauf wie gestern
AUSNAHME:
Vermessung der DNA-Lösung mit Hilfe eines NanoDrops (so haben wir erkannt, dass die DNA-Lösung verschmutzt ist) und daraufhin DNA-Aufreinigung (WIZARD SV Gel + PCR Clean-Up System) um ein genaues PCR-Ergebnis zu erhalten

2. Schritt) FISH

18. 8. 2009
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) basiert auf dem Prinzip, dass sich ein einzeler Strang der DNA an einer komplementären DNA-Sequenz anlagert und sich dort bindet. So wird die Ziel-DNA und eine passend ausgewählte markierte DNA-Sonde in einer Formamidlösung durch Hitze denaturiert bzw. die DNA-Doppelhelix teilt sich. Die Sonden sind einzelsträngige Nukleinsäuren, die spezifisch an genau definierte Zielnukleinsäuren hybridisieren (=binden). Um diese Sonden wiederfinden zu können, sind sie in diesem Fall mit einem Floureszenzfarbstoff versehen, wobei nun ein bestimmter Bereich eines Genoms farbig dargestellt ist und nun ermöglicht ein Floureszenzmikroskop die gewünschte Identifikation.


Vorfixierung:
•3 min equilibrieren in 2x SSC
•100 µl RNase > 30 min bei 37°C (Deckglas)

Pepsinverdau/ Fixierung:
•1-2 min 5-10 µl/ 100ml Pepsinlösung
•2x waschen in PBS > 5 min
•1x waschen in PBS/ MgCl2
•10 min Formaldehyd/PBS/MgCl2
•5 min in PBS waschen
•Ethanolreihe je 3 min 70%, 90%, 100%

Denaturierung:
•2 min bei 80°C Formamid/SSC
•eiskalte Ethanolreihe je 3 min 70%, 90%, 100%
•< 1 min bei 40°C
•10 µl denaturierte Sonden

21. 8. 2009
Superfrost Plus Objektträger, poly-2-beschichteter Membranobjektträger > EVS 7603 > H&E Färbung > Morphologie?

1. Objektträger: Cryoschneiden EVS 7603, H&E Färbung
2. Objektträger: Cryoschneiden EVS 7603, 30'' Aceton, H&E Färbung
3. Objektträger: Cryoschneiden EVS 7603, 30'' Aceton, 1' Pepsin,H&E Färbung
4. Objektträger: Cryoschneiden EVS 7603, 30'' Aceton, 2' Pepsin,H&E Färbung
5. Objektträger: Cryoschneiden EVS 7603, 1' Pepsin, H&E Färbung
6. Objektträger: Cryoschneiden EVS 7603, 2' Pepsin, H&E Färbung
7 Glasobjektträger: Cryoschneiden EVS 7603, 30'' Aceton, 2'' Pepsin, H&E Färbung
8. Glasobjektträger: Cryoschneiden EVS 7603, 2' Pepsin, H&E Färbung

ERGEBNIS:
alle Schnitte sind noch da
Morphologie bei Pepsin-Behandlung deutlich schlechter also ohne
Gewebe EVS 7603 ist gegenüber BIP 8104 besser