Der heutige Tag war leider, nach drei sehr lehrreichen und interessanten Wochen im Labor, der letzteTag an der Uni Wien.
Wie sich glücklicherweise herausgestellt hat war tatsächlich das Gerät an unseren gestrigen schlechten Proben schuld.
Da heute im Labor Putztag angesagt war, durften wir leider nicht mehr arbeiten.
Aus diesem Grund haben wir uns herzlich verabschiedet, uns für das Praktikum bedankt und anschließend hitzefrei erklärt bekommen.

Heute haben wir unseren Betreuer ,damit wir nochmals die Möglichkeit haben zu sehen wie Massenspektrometrie funktioniert, zum zweiten Mal in die Bohrgasse begleitet.
Wie beim letzten Mal haben wir zuerst einige Einstellungen am Gerät vorgenommen.
Nach einigen Laserschüssen mussten wir aber leider feststellen, dass keine Peptide ausfindig zu machen waren.
(was aber angeblich am Gerät lag)
Da wir beim Suchen nach dem technischen Defekt nicht wirklich behilflich sein konnten, wurden wir für heute entlassen.

Nachdem wir gestern den Verdau angesetzt haben war die heutige Aufgabe logischerweise den Verdau zu stoppen, bei welcher wir uns nun schon nach zahlreicher Übung ziemlich geschickt anstellten.
Als alle Proben auf der multi- target Platte aufgetragen waren, hat uns Barbara unter dem Mikroskop einige Amöben gezeigt, was natürlich sehr interessant war.

Hi!
Da unser Betreuer ,Dr. Christian Heinz, ein weiteres Mal in die Bohrgasse gefahren ist um herauszufinden ob sich in unseren Proben auch wirklich Peptide befinden haben wir selbstständig einen neuen Verdau angesetzt. Bei etwaigen Schwierigkeiten konnten wir aber natürlich jederzeit Christians Diplomandin um Hilfe fragen.
Aber glücklicherweise haben wir dann doch alles und das sogar noch relativ schnell hinbekommen.

Hallo!
Heute haben wir eigenhändig 2DE -Gele gegossen.
Um dies zu tun braucht man:
Acrylamid
HCL
milliq
10%SDS
10%APS
10%Temed
In einem großen Messkolben haben wir diese Mischung mittels Rührfisch auf einer Art Wärmeplatte erwärmt,
beim Zuführen von Temed kommt es zur Polymerisation.
Nach ein paar Sekunden durften wir schließlich das flüssige Gel in die Platten gießen, die wir zuvor mühevoll gereinigt hatten.
Eine Stunde später war das Gel so fest, dass wir die Platten auseinander schrauben konnten, immer die zwei Platten, in welchen das Gel eingeschlossen war, haben wir in feuchte Tücher + Frischhaltefolie eingewickelt und in den Kühlschrank gelegt.
Die Platten dazwischen haben wir zum Trocknen aufgestellt.
Nach der Mittagspause habe ich begonnen die Nutips zu waschen (siehe letzte Woche); wie gehabt 20 Mal auf und ab pippetiert und die verwendete Spitze in einen größeren Eppi, natürlich mit der gleichen Beschriftung,verwahrt.
Nach der folgenden Eluierung habe ich die Proben schlussendlich auf die Stahlplatte "gespottet".

Wie sich leider in der Dr. Bohrgasse herausgestellt hat waren die Proben ohne Reduzieren und Alkylieren wesentlich schlechter als zuvor und aus diesem Grund haben wir den Verdau wieder wie ursprünglich angesetzt.
Zu unserem Erstaunen waren wir diesesmal schon um einiges schneller fertig als in der ersten Woche und das obwohl wir alles ohne Hilfe gemacht haben.

Da unser Betreuer in die Dr. Bohrgasse gefahren ist um unsere Proben, die wir diesmal ohne Reduzieren und Alkylieren gewonnen haben, zu untersuchen, haben wir uns dem Ausstechen von weiteren Spots gewidmet und eine totale, unglaubliche Anzahl von 92 Spots aus dem Acrylamidgel ausgestochen und sicher in Eppis verwahrt.
Diese haben wir im Anschluss daran bei - 80 Grad eingefroren.

Heute haben wir die Peptidgewinnung von gestern fortgesetzt, also die Peptide aus dem Brutraum geholt und den Verdau mit 10 % TFA gestoppt.
Der nächste Schritt war die Peptide 10 Minuten zu beschallen.
Diesem folgte unmittelbar darauf das Waschen der Nutips mit 0.6 % TFA und 70 % ACN.
Zwecks Bindung haben wir 20 Mal auf und ab pippetiert.
Nach dem Eluieren haben wir zu guter letzt die Peptide auf die Stahlplatte für die Charakterisiierung mittels Massenspektrometrie aufgetragen.

Am Dienstag haben wir mit dem Gewinnungsvorgang der Peptide aus 2D- gelen , wie auch in der ersten Woche, nochmals gestartet.
Wir haben sozusagen den Verdau durch Trypsin angesetzt.
Dafür haben wir als Erstes 20 Proben aus dem Gelstück ausgestochen, sie in 200 Mikroliter Wasser gesetzt und sie mit dem Eppischüttler bei 20 Grad gewaschen. Diesen Vorgang haben wir anschließend zwei Mal wiederholt.
Während des Schüttelns haben wir den Entfärber, der aus einer 50:50 Mischung aus ACN und Wasser besteht hergestellt. Nach dreimaligem Schütteln mit dieser Lösung konnten wir das Coomassiblau des Geles hinauswaschen.
Die Gelstückchen wurden mit 80 Mikroliter ACN geschüttelt und wir konnten beobachten, dass die Stückchen zusammenschrumpften und eine weiße Färbung annahmen. Nach dem Wegschütten des Überstandes haben wir die Proben in der Speedvac getrocknet , danach das Enzym aufgetragen und sie in den Brutraum gebracht.

Aufgrund einer Teambesprechung unseres Betreuers waren wir den ganzen Vormittag auf uns allein gestellt.
Unsere Aufgabe war es die Peptide der gesamten rechten Seite des Gels auszustechen.(wir sind insgesamt auf 72 Proben gekommen)
Die weitere Vorgehensweise war die des ersten Tages, daher wussten wir glücklicherweise was zu tun war.
Erstmals haben wir die Proben mittels Eppischüttler mit Wasser gewaschen, dann den Farbstoff des Gels, dem Coomassiblau, mit einem von uns selbst hergestellten Entfärber, entfernt.
Der nächste Schritt war es ACN hinzuzugeben, die Peptide fünf Minuten zu schütteln und danach in der Speedvac zu trocknen. Nachdem Einwirken von Iodoaetamid (30 min) haben wir die Peptide nochmals in die Speedvac gestellt, um danach das Enzym Trypsin,welches zuvor eingefroren war, auf diese zu pipettieren. Die Proben haben wir über Nacht zum Verdau in den Brutraum gebracht.
Als wir mit allem fertig waren, also so ca. um halb neun, waren wir die letzten im Labor. Das klingt jetzt vielleicht ein bisschen beängstigend aber als Wissenschaftler kann man nunmal einfach nicht mitten in einem Vorgang aufhören. :-)

Heute waren wir in der Dr. Bohrgasse um mithilfe der Massenspektrometrie festzustellen, ob es sich bei unseren Proben, die wir aus dem 2d- gel ausgestochen haben, auch wirklich um Peptide handelt.
Bevor wir dies getan haben mussten wir rund um unsere Proben auf der Stahlplatte bereits identifizierte Peptide, von welchen die Masse bereits bekannt war, auftragen.
(zur Kalibrierung)
Anschließend durften wir am Computer einige Einstellungen am Massenspektrometer vornehmen, wie zum Beispiel die Anzahl der Laserschüsse einstellen und das Schussareal bestimmen.
Natürlich haben wir auch sehr detailierte Erklärungen über die Funktionsweise des Gerätes erhalten.
Nachdem der Massenspektrometer alle Proben vollständig beschossen hatte, hat uns unser Betreuer verschiedene Möglichkeiten der Analyse von Peptiden gezeigt .

...das Praktikum geht spannend weiter!
Um ca. neun Uhr haben wir uns heute unsere, von gestern im Brutraum deponierten Proben, wiedergeholt und zu extrahieren begonnen.
Das Ziel des heutigen Tages war es die Peptide aus dem Gel "hinauszuwaschen" um sie auf eine Edelstahlplatte mit einer Matrixlösung aufzutragen.

Hallo!
Ich absolviere mein drei- wöchiges Praktikum gemeinsam mit einem zweiten summer- school Praktikannten an der Uni Wien im Department für mikrobielle Ökologie.
Unser Projekt versucht Ergebnisse der Genomanalyse von Umwelt- Chlamydien mit Analysen auf der Ebene der Proteine zu ergänzen
Unser Betreuer, Dr. Christian Heinz hat uns erstmals sein Forschungsprojekt vorgestellt, über seine bisherigen Ergebnisse berichtet und uns die wichtigsten Begriffe erklärt.
Sehr mutig von unserem Betreuer fand ich, dass er uns anschließend sofort selbst "forschen" ließ.
Auf einem 2-D Gel mit Aminosäuren durften wir uns 6 Spots aussuchen und ausstechen. Danach haben wir mit dem Waschen der Spots begonnen, das vom Entfärben und anschließendem Trocknen gefolgt wurde.
Bevor unser Arbeitstag zu Ende war haben wir unsere Proben zum "Verdau" (Enzyme wurden zugeführt) in den Brutraum, der eine Temperatur von 37 Grad hat, gebracht.
Zwischendurch hat sich unser Betreuer die Zeit genommen, um uns in einem Buch die verwendeten Methoden besser zu erklären und uns zum Einlesen in die Materie papers gebracht.