An dieser Stelle möchte ich allen Menschen, die ich in diesen drei Wochen kennengelernt habe ganz herzlich danken für alle ihre Mühen und für all diese Geduld meine vielen Fragen so gut und ausführlich beantwortet zu haben.
Ich bin sehr dankbar und froh, dass ich mich damals in den Osterferien hingesetzt habe und mein Motivationsschreiben geschrieben habe und nun die Möglichkeit hatte dieses Praktikum zu machen.
Ein besonders großer Dank gilt natürlich Gordin Zupkovitz, meinem Betreuer, der mich die ganzen drei Wochen als Anhängsel am Hals hatte und das wirklich toll gemeistert hat, auch wenn es sicher nicht immer leicht war.
Danke Gordin!
Natürlich danke ich auch Christian Seiser, der bereit war mich in seinem labor aufzunehmen.

Weiters möchte ich summerschool danken, dass sie SchülerInnen diese einmalige Chance gibt ohne großen Strss oder Verantwortung in den Forscheralltag schnuppern zu können.

Es waren sehr lernreiche, anstregende, aber wunderschöne drei Wochen.
Dankeschön!

Der letzte Tag war angebrochen....
mit ein bisschen verspätung möchte ich heute über meinen letzten "arbeitstag" im LabSeiser berichten.
Am letzten tag hatte mein betreuer mir gesagt soll ich einen kuchen oder eine torte mitnehmen. also habe ich am donnerstagabend eine zitronentopfentorte gebacken und siehe da sie ist sogar sehr gut gelungen (ja ich weiß eigenlob stinkt, aber die war wirklich sehr gut:-))

jetzt aber: was haben wir überhaupt noch gemacht....
naja nicht mehr so viel. wie ihr euch vielleicht erinnert war das der "heißeste tag im sommer07" und wie ihr euch sicher auch erinnert funktionierte die klimaanlage bei uns im labor nicht so super....

im großen und ganzen haben wir genau das gleiche wie am donnerstag gemacht nur das wir heute unsere proben auf die DNAregionen C, D und E überprüft haben.
eine DNA sequenz wird nämlich in verschiedenen abschnitte eingeteilt wo auch verschiedene primer benutzt werden, um dorthin zu kommen.
am donnerstag waren die regionen A und B dran und heute eben der rest bis E.
also haben wir realtime PCR und normales PCR gemacht.
Ergebnis realtime PCR: Nicht ganz gut gelungen, aber noch OK.
Primer C: die KO- Azetylierung steigt bei H4
Primer D: H3 Azetylierung in KO zellen ist relativ stark gestiegen, was ein wenig überraschend ist.
Primer E: keine nennenswerten Unterschiede.
Input: die werte befinden sich nicht wie erwartet um den Wert 1.
cDNA: WT hat eine höhere Azetylation als KO zellen außer in der Region E.
WT: H4 ist stärker azetyliert als H3, außer die RegionA, die gleich ist.
KO: H3 und H4 sind ziemlich gleich stark azetyliert.
nur bei der region A ist H4 stärker azetyliert als H3 und bei der region E ist H3 stärker azetyliert.

Gordin wird jetzt noch die restlichen DNA regionen bis Y überprüfen und dann alles noch zweimal zur besseren überprüfung mahcen (also auch mit ChIP und allem...)

Ergebnis PCR durch gelelektrophorese: sehr ähnlich dem ergebnis von donnerstag, HDAC1 ist nicht vorhanden.
Gordin wird auch das alles noch einmal mahcen.

natürlich musste ich mich auch noch ein letztes mal um meine zellen "kümmern". das kümmern ist heute leider in anführungszeichen, da ich die zellen heute wegschmeißen musste, weil gordin selbst schon genügend zellen hat.
sie hatten ein schönes leben bei mir, da bin ich mir sicher...

zu meiner verabschiedung ist dann auch noch fast das ganze labor ins lokal concordia (gegenüber des tor1 vom zentralfriedhof) essen gegangen.
das war wirklich nett und die schnitzel sind hervorragend dort, wirklich weiterzuempfehlen!!
(wen es interessiert: ich habe das schnitzel "Karl Valentin" gegessen- eingerolltes schnitzel+ normaler panier+ semmelknödel, grammeln, schinken, käse und noch irgendeiner fülle und einem guten salat dazu:-) war sehe, sehr gut...)
meine torte ist dann auch gut angekommen, jedenfalls hoffe ich das...

ja und um 17.00 war es dann auch schon zu ende...

hi jetzt ist das praktikum wirklich schon in den letzten atemzügen...

also gleich in der früh haben wir zwei PCRs gemacht.
einmal ein real- time PCR mit den ChIP Proben von gestern, aber nur mit den proben, die wir auf eine azetylierung untersucht haben, da diese proben weniger cycles benötigen, als die proben, die wir auf HDAC überprüfen.
und dann haben wir eben noch eine zweite PCR mit den HDAC proben gemacht.
wir überprüften zwei nahe beeinanderliegende DNA regionen mit jeweils einem reverse und einem forward primer, nämlich die IL4A & IL 4B Gene (IL=Interleukin).


Ziel: bei der Primer Region, die wir uns vorher rausgesucht haben, wird nun überprüft ob die proteine oder Azetylgruppen, usw. auf dieser region angehängt sind und wenn ja wie viele.
in den verschiedenen proben sind ja verschiedene DNA stücke, die bei ChIP über geblieben sind, da sich die spezifischen Ab immer auf ihr spezielles ziel gesetzt haben, aber der rest ja dann weggewaschen wurde.
die bestimmten primer könne aber nur "ihre" region vervielfältigen. wenn also in den proben keine von diesen Regionen über geblieben ist, dann wird sich auch bei den PCRs nichts tun. und das gleich natürlich auch umgekehrt.
so weiß ich dann im verhältniss wie viel über geblieben ist, wie viele von diesen Epigenetischenfaktoren am dieser stelle zu finden sind.
ergebnis von real-time PCR: ist ganz okay, so wie erwartet.
ergebnis von PCR durch gelelektrophorese: auch ganz okay, HDAC2 und inputs sind sehr stark. HDAC1 ist fast nicht zu sehen.


ja was habe ich sonst heute noch gemacht...
ich wurde für summerschool im Penninger Labor im IMBA zusammen mit zwei (eigentlich drei, da eine exsummerschoolerin auch dabei war) anderen summerschoolern gefilmt! das wird dann,wenn es war ist nächste woche in goTV als spot oder so ausgestrahlt.
also: nächste woche goTV schauen!!!!!
was haben wir gemacht: zuerst wurde der leiter des gen- au projekts interviewt. dann wurden wir drei neuen summerschooler von eine(r?) scout interviewt. für die war es auch das erste mal, dementsprechen nervös waren wir.
aber es ging alles gut.
sie fragte uns was wir uns vorher vom laboralltag vorgestellt haben, wie wir unsere berufschancen in einem wissenschaflichen milieu einschätzen, was uns während summerschool überrascht hat, uvm. aber das alles können wir ja hoffentlich bald im fernsehen sehen....
danach wurde noch die summerschoolerin06 interviewt: was sie so von summerschool im nachhinein denkt, was es ihr gebracht hat, usw.
dann haben wir (also jeder eins bzw. zwei sachen) gewisse laborvorgänge vorgeführt: gelelektrophorese laden, zellen füttern, fliegen zählen und gel von der gelelektrophorese unters UV licht geben. letzteres ist mir zugefallen, natürlich der part wo man einen ganz schicken schutzhut tragen muss.
irgend wie typisch für mich....
doch im großen und ganzen war die ganze dreherei sehr nett und ich habe schon wieder was neues kennengelernt, da ich noch nie fürs fernsehen gefilmt wurde. und neue leute (vor allem mal andere summerschooler) habe ich auch kennengelernt und das kann auch nie schaden.

dann waren wir natürlich noch inder zellkultur uns um unsere zellen kümmern, alos media wechseln.

ja das war ein sehr schöner vorletzter tag...
jetzt werde ich schon langsam richtig traurig und will nicht weg... naja dann ahbe ich endlich ferien, das ist auch sehr, sehr nett:-)

ja es stimmt ich bin nur mehr (+heutigem tag) drei tage im labor. die zeit ist wahnsinnig schnell vergangen, obwohl ich das in so manchen wartezeiten zwischen den versuchen nicht geglaubt hätte...
im labor ist es heute ziemlich heiß, da die klimaanlage nicht gut arbeitet. gordin hat mir aber gesagt, dass das schon seit ca. 5 jahren so geht, aber die dafür zuständigen menschen kümmern sich nicht darum...müssen auch nicht hier drin sitzen!

naja was haben wir heute gemacht bzw. angefangen: natürlich haben wir mit ChIP weiter gemacht, Protokoll tag 3.
das de- crosslinking hat hoffentlich über nacht funktioniert und heute machten wir dann mit dem PCI weiter, die die von der DNA abgetrennten proteine abwäscht (siehe voriger blog). danach ist hoffentlich nur mehr die gesuchte und gewolte DNA über.
bevor wir eine gelelektrophorese (ich darf das gel vorbereiten) und später eine realtime PCR machen, behandelt gordin die proben noch alle mit RNAse(zerstört RNA), um sicher zu gehen, dass keine RNA bei der DNA noch dabei ist, da sonst das PCR und die gelelktrophorese nicht richtig funktionieren würden.
ergebnis der gelelktrophorese: alles ist ok, proben haben richtige größe (400- 500bp). gordin hat nur die inputs kontrolliert+ einem marker.

dazwischen haben wir die blots, die wir in den vorigen tagen behandelt und entwickelt haben, in den computer gescannt, um mit hilfe von photoshop eine übersicht zu machen.
das haben wir mit den HDAC1 & 2 und dem b(beta)- actin blot gemacht.
wobei der b-actin blot eigentlich nur als beweis genommen wird, dass wir überall die gleiche menge an DNA benützt haben, da b- actin nicht durch die abwesenheit von HDAC1 beeinflusst wird und somit überall, in jeder zelle gleich bleiben sollte. was bei uns auch so war.
auch haben wir die blots mit H3Ac und H4Ac gescannt.

die tägliche zellfütterung durfte natürlich auch heute nicht fehlen. wir ahben dann auch noch TRIPSIN aufgeteilt und ein neues ES- media hergestellt.

so das wars mal wieder für heute.
lg barbara

Hier möchte ich kurz erklären wie ChIP (= Chromatin Immunpräzipitation) vor sich geht.

Ziel von ChIP: Man überprüft bestimmte Proteine, die an irgendwelchen unbekannten Stellen an die DNA gebunden sind. Durch ChIP ist es möglich diese unbekannten Stellen auf der DNA bekannt zu machen. Danach weiß man wo genau auf der DNA dieses Protein angehängt ist.

1) Crosslinking: Die DNA der Proben werden mit Formaldeyhd stark an das Chromatin (die Histone) fixiert.
2) Sonication: Der DNA Faden wird mit hilfe von Ultraschallwellen in die gewünschte Länge geteilt (bei uns 500bp).
3) Immunpräzipitation: Spezielle Antikörper (z.B. für HDAC1,usw.) werden auf die Proben gegeben, die sofort ihr spezielles Ziel erkennen und sich dort festmachen.
4) Beads Dazugabe: Nun werden Beads (z. B. vom ProteinA) zu den Proben dazugeben. die sich wiederum auf ihrem speziellen Antikörper anhängen.
5) Washing: Nach einer bestimmten Einwirkszeit werden die Proben mit RIPA, High Salt, LiCl und TE gewaschen.
Grund: Der ganze Rest an den sich keine Antikörper und somit keine Beads gebunden haben wird weggewaschen, da das alles einen sehr starken Background ergeben würde, den wir nicht wollen.
6) Wasching+ Elution Buffer: Nun werden die übergebliebenen Proben von den Beads und Antikörpern befreit.
7) De- crosslinking (Proteidigestion): Nun werden die speziell gesuchten Proteine zerstört.
8) Mit Hilfe von PCI werden die Proteinreste und alle anderen nicht benötigten Reste weggewaschen.
9) Nur mehr die DNA ist über.
Ziel erreicht.
Meistens wird die DNA jetzt mit PCR vervielfältigt, um dann bei einer Gelelektrophorese genau überprüft zu werden.

hallo an diesem wunderschönen sommertag, der dank klimaanlage halbwegs gut im labor zu ertragen ist...

haben heute die schon am freitag vorbereitete IF im Mikroskop kontrolliert.
Ergebnis: Einige proben waren sehr gut, alles erwartete war sichtbar, andere wiederum nicht so gut.
zur erinnerung wir kontrollierten AcH4 & HDAC1, KO & WT, +&- KCl Behandlung und ES oder DA Zellen.
konnten einige nette bilder von DNA und azetylierung machen.

Dazwischen haben wir unsere b(beta)actin membran mit 2nd Ab (Maus) behandelt.

natürlich haben wir auch mit dem ChIP weiter gemacht.
wir haben die beads jetzt so weit, das sie an unsere Ab binden und waschen die proben nun vom rest, den wir nicht benötigen frei, da sonst background enstehen würde.
Nach diesem waschen, waschen wir unsere proben noch einmal mit elution puffer. nun werden die beads und die Ab heruntergewaschen. im nächsten schritt (de-crosslinking) werden die proteine über nacht von der DNA entfernt.

das ziel von ChIP ist zu erkennen wo genau die proteine, die man überprüft (HDAC1, TF,...) auf der DNA sind. am ende ist also nur mehr DNA über, die mit hilfe von PCR überprüft wird.

Natürlich waren wir auch wieder in der zellkultur uns um unsere zellen kümmern. dazu haben wir auch wieder ien paar zellen geteilt.

ja das wars auch schon wieder für heute.
habe grade vorhin erfahren, dass ich am donnerstag gefilmt werde für goTV zusammen mit anderen summerschoolern.
naja.... schaun wir mal wie das wird.
lg und allen noch ganz viel spaß im labor und hoffentlich hab ihr auch viel spaß im bad in der sonne liegend...:-):-)
danach weiß ich das z. B. auf diesem stück DNA eine azetylierung oder HDAC1 usw. angehängt ist.

hi!
ich hätte letzte woche nicht so übers wetter lästern sollen, jetzt ist es ein bisschen zu heiß geworden.... aber gottseidank gibts ja klimanlagen im labor.
die woche muss ich jetzt wirklich genießen, weil es die letzte ist. vielleicht werde ich so was nie wieder erleben...

naja ich schweife ab...
gordin hat am freitag die histonDNA proben noch einmal beschallt, daher müssen die heute noch mal auf die größe kontrolliert werden.
wir machen daher dasselbe wie freitag noch einmal.
also auch mit gelelektrophorese und so. (wobei ich das gel laden darf:-))
ergebnis der gelelektrophorese: alles ist ok, die proben haben die richtige größe (500bp).
danach will gordin mit der HistonDNA ein ChIP (=Chromatin Immunopräzipitation) machen. das ziel von ChIP ist es zu erkennen ob´bestimmte proteine bestimmte chromatinteile binden.
dazwischen bereiten wir aber auch beads vor, welche die Ab, die auf den proteinen, die auf der DNA, die wiederum auf den histonen sind, erkennen. das ziel ist also, eine spezielle DNA (finden wir mit Ab) zu bekommen, die auf den histonen oben ist. mithilfe von beats, die es in zwei arten gibt: für poly- und für monochlonal (?) Ab (also Ab die für ein protein spezifisch sind oder sich auf mehrere proteine stürzen können), ist es möglich chromatin viel genauer zu kontrollieren und zu überprüfen.
die beads (in pulver oder gelähnlichen form) werden daher in TE (wasser + puffer) aufgelöst, damit sie in bisschen anschwellen. nach einer halben stunde einwirkszeit in eis werden die proben zentrifugiert und von der restflüsssigkeit gereinigt. danach werden die beats 3mal mit TE gewaschen und zentrifugiert.
als das erledigt ist wird die menge an beads mit hilfe eines vergleichseppis gemessen.
nun kommt noch für einige stunden eine mischung aus BDA, SS DNA udn TE dazu,so dass die beads alles unspezifische, was wir nicht brauchen an sich binden kann, was wir dann weggeben können.

mithilfe von ChIp überprüfen wir dann die folgenden proteine: HDAC1&2, AcH3, AcH4, cH3.
die 1st Ab werden wieder über nacht auf unsere histonDNA gegeben, um richtig gut wirken zu können.

zwischendurch machen wir mit einer WBmembran weiter, die wir mit PBS- tween gewaschen und mit milch blocken, um später B(das sollte ein beta sein)-actin 1st Ab über nacht dazuzugeben.

unsere zellen (ja unsere, weil ich hab jetzt auch zellen:-))werden natürlich auch kontrolliert und gefütter. heute musste ich meine zellen zum ersten mal splitten, weil sie schon enorm gewachsen sind.

ja das wars für heute, ab ins bad!!!!!!!!!!