Sequenziermethoden
19:47 / 02.08.2006
Leider habe ich bis jetzt nicht die Zeit gefunden, euch über meine Erkentnisse zu diversen Sequenziermethoden zu informieren. Hier aber nun, wie versprochen, eine kurze Zusammenfassung meiner Recherchen:
Im Allgemeinen gibt es zwei Verfahren zur Bestimmung von DNA-Sequenzen. Zum einen die chemische Methode von A.M. Maxam und W. Gilbert (1977) und die biochemische Dideoxy- oder Kettenabbruchmethode von F. Sanger (1977).
Obwohl die Kettenabbruchmethode relativ umständlich ist, wird sie auf Grund ihrer Verlässlichkeit und Genauigkeit bevorzugt und mehr als 98% der gewonnenen DNA-Sequenzen in internationalen Datenbanken sind durch diese Methode entschlüsselt worden. Deshalb werde ich nur diese Methode kurz erläutern:
(1) Zuerst wird die DNA in M13-RF-DNA kloniert mit dem Ziel einzelstränngige DNA Ringe herzustellen. Man verwendet dafür Derivate des natürlichen M13 - Phagen und überpfrüft die Klonierung durch eine Blau-Weiß Selektion
(2) An der multiplen Klonierungsstelle (MCS) von M13 lagert sich ein DNA-Primer an
(3)Die dann hinzugefügte DNA-Polymerase benützt das 3'OH Ende des Primers und synthetisiert einen Komplementärstrang. Meistens verwendet man für diesen Vorgang die T7-DNA Polymerase (Bakteriophage T7)
(4) Der Trick dieser Methode besteht in der gezielten Unterbrechung der Komlementärstrnag Synthese. Dies erreicht man durch den Zusatz von Dideoxynucleotiden (ddNTP) zu dem Gemisch von normalen dNTPs, da ddNTPs keine 3'OH Gruppe besitzen, sodass die Synthese unterbrochen wird.
Konkret geht man also folgender Maßen vor:
(a) Man bereitet 4 Ansätze parallel vor, wobei jeder Ansatz ein markiertes (entweder durch Radioaktivität oder Fluoreszenz) Nucleotid und die drei anderen nichtmarkierten Deoxynuleosid-Triphosphate enthält. Zu den 4 dNTPs (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) enthält jeder Ansatz zudem ein Dideoxynucleotid (also der erste zum Beispiel ddTTP, der zweite ddCTP, der dritte ddGTP und der vierte ddATP)
(b) Dann setzt man die DNA-Polymerase zu, welche die Komlementärstrang Synthese beginnt. Sie kommt zum Halt, wenn zufällig ein Dideoxynuleotid statt des normalen Deoxynucleotids in das Zentrum der DNA Polymerase gelangt. Beim ersten Ansatz in unserem Beispiel wäre das immer der Fall, wenn die Sequenz des Matrizenstranges den Einbau eines Thymin Nucleotids verlangt, beim zweiten bei einem Cytosin Nucleotid usw. Man erhält also im ersten Ansatz DNA Fragmente, deren Längen die Positionen von Adenin Resten im Matrizenstrang wiedergeben usw.
(c) Im nächsten Schritt müssen matrizen und synthetisierter Komplementärstrang durch Denaturierung aufgetrennt und auf Polyacrylamid-Gelen analysiert werden. Nur die Syntheseprodukte sind markiert (z.B. durch radioaktiven Phosphor), daher können auch nur sie durch geeignete Maßnahmen sichtbar gemacht werden. Durch das kleinste, am weitesten gewanderte Fragment, wird das erste Nucleotid in der Sequenz angezeigt, durch das nächst größte Fragment das zweite usw.
Ich hoffe, ich konnte diese doch recht komplizierte Sequenziermethode doch einigermaßen verständlich erklären!
Im Allgemeinen gibt es zwei Verfahren zur Bestimmung von DNA-Sequenzen. Zum einen die chemische Methode von A.M. Maxam und W. Gilbert (1977) und die biochemische Dideoxy- oder Kettenabbruchmethode von F. Sanger (1977).
Obwohl die Kettenabbruchmethode relativ umständlich ist, wird sie auf Grund ihrer Verlässlichkeit und Genauigkeit bevorzugt und mehr als 98% der gewonnenen DNA-Sequenzen in internationalen Datenbanken sind durch diese Methode entschlüsselt worden. Deshalb werde ich nur diese Methode kurz erläutern:
(1) Zuerst wird die DNA in M13-RF-DNA kloniert mit dem Ziel einzelstränngige DNA Ringe herzustellen. Man verwendet dafür Derivate des natürlichen M13 - Phagen und überpfrüft die Klonierung durch eine Blau-Weiß Selektion
(2) An der multiplen Klonierungsstelle (MCS) von M13 lagert sich ein DNA-Primer an
(3)Die dann hinzugefügte DNA-Polymerase benützt das 3'OH Ende des Primers und synthetisiert einen Komplementärstrang. Meistens verwendet man für diesen Vorgang die T7-DNA Polymerase (Bakteriophage T7)
(4) Der Trick dieser Methode besteht in der gezielten Unterbrechung der Komlementärstrnag Synthese. Dies erreicht man durch den Zusatz von Dideoxynucleotiden (ddNTP) zu dem Gemisch von normalen dNTPs, da ddNTPs keine 3'OH Gruppe besitzen, sodass die Synthese unterbrochen wird.
Konkret geht man also folgender Maßen vor:
(a) Man bereitet 4 Ansätze parallel vor, wobei jeder Ansatz ein markiertes (entweder durch Radioaktivität oder Fluoreszenz) Nucleotid und die drei anderen nichtmarkierten Deoxynuleosid-Triphosphate enthält. Zu den 4 dNTPs (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) enthält jeder Ansatz zudem ein Dideoxynucleotid (also der erste zum Beispiel ddTTP, der zweite ddCTP, der dritte ddGTP und der vierte ddATP)
(b) Dann setzt man die DNA-Polymerase zu, welche die Komlementärstrang Synthese beginnt. Sie kommt zum Halt, wenn zufällig ein Dideoxynuleotid statt des normalen Deoxynucleotids in das Zentrum der DNA Polymerase gelangt. Beim ersten Ansatz in unserem Beispiel wäre das immer der Fall, wenn die Sequenz des Matrizenstranges den Einbau eines Thymin Nucleotids verlangt, beim zweiten bei einem Cytosin Nucleotid usw. Man erhält also im ersten Ansatz DNA Fragmente, deren Längen die Positionen von Adenin Resten im Matrizenstrang wiedergeben usw.
(c) Im nächsten Schritt müssen matrizen und synthetisierter Komplementärstrang durch Denaturierung aufgetrennt und auf Polyacrylamid-Gelen analysiert werden. Nur die Syntheseprodukte sind markiert (z.B. durch radioaktiven Phosphor), daher können auch nur sie durch geeignete Maßnahmen sichtbar gemacht werden. Durch das kleinste, am weitesten gewanderte Fragment, wird das erste Nucleotid in der Sequenz angezeigt, durch das nächst größte Fragment das zweite usw.
Ich hoffe, ich konnte diese doch recht komplizierte Sequenziermethode doch einigermaßen verständlich erklären!
