Heute war es soweit, endlich konnte ich die Ergebnisse der Hybridisierung betrachten!!! Fabelhaft! Dachte ich mir zumindest in der Früh...
Die erschreckend ernüchternde Realität sah dann so aus, dass ich gemeinsam mit meiner Kollegin die Ehre hatte, 4 eingescannte Slides, also 8 Bilder (High- und Lowscan), dementsprechend 238464 Spots zu überprüfen. Dies dauerte den gesamten Tag. Mache ich nun meine Augen zu, sehe ich nur noch rote und grüne Punkte. Oh mein Gott, sie kommen immer Näher!! Hilfe! Ich werd mal abhaun und mich an einen sichereren Ort begeben...

Die Genchips müssen nach dem Hybridisieren gewaschen werden. Dies macht man mit 3 verschiedenen Waschbuffern, in denen der Genchip jeweils 5 Minuten lang mit einer Maschine geschüttelt herumschwimmt.
Kurz in Wasser eingetaucht, gehts schon weiter in eine Zentifuge, in der der Microarray getrocknet wird.

Danach folgt das Einscannen. Dieser Vorgang muss genauestens überwacht, die Strahlung des Scanners an die Färbung des Genchips angepasst werden. Zweimal muss jerder Slide gescannt werden, einmal mit niedriger, einmal mit hoher Strahlung.
Beim Scannen wird sichtbar, an welchen Slots die cDNA viao Wasserstoffbrückenbildung andocken konnte.

Heute ging es, wie erwartet, am Morgen nicht ins wohlvertraute Labor, sondern in den Seminarraum, den ich mit den langwierigen Theoriesessions der ersten Woche assoziiere. Aber diesmal wurden meine drei Kolleginnen und ich nicht mit einem wüsten Gewirr von Dogmata der Molekularbiologie und unverständlichen Abkürzungen, sondern mit der guten Nachricht, unser Projekt könne, zwar in anderer Weise als geplant, aber immerhin, realisiert werden, empfangen.

Wir werden im weiteren Verlauf nicht zum fasten angeregte, das dominant negative Gen Nur77 enthaltende Zellen mit normalen zum Fasten angeregten vergleichen, sondern Zellen, die mit einem Hormoncocktail zum Fasten angeregt wurden mit Zellen, bei denen nur ein Medienwechsel durchgeführt wurde (ohne Hormongebräu) zu mehreren Zeitpunkten vergleichen. Eine akzeptable Alternative.

Nach der Besprechung begaben wir uns (unsportlich wie immer den Lift nehmend) in das Labor, wo wir die gestern mit Proben hybridisierten Microarrays wuschen und einscannten.

Den Vorgang des Einlesens kontrollierte ich am Computer und nahm eventuell notwendige Veränderungen in der Bestrahlung der Genchips durch den Scanner vor. Sylvia war für diese Aufgabe nicht zu begeistern.

Von unseren Betreuern wurden wir schon nach der Mittagspause (in der wir via Pizza für das Wohlergehen auch unserer Fettzellen sorgten) entlassen, man riet uns jedoch, dass es Sinn habe, sich schon jetzt mit der Realisierung der Abschlussdokumentation zu beschäftigen, sprich: frühere Berichte Anderer durchzulesen und zumindest mit der Einleitung unserer zu beginnen.

Morgen werden wir von Andi in den Gebrauch gewisser bioinformatischer Computertools eingeführt. Ihrer weiblichen Natur folgend bedeutet das für meine Kolleginnen einen verhängnisvollen Freitag. Ich werde mich dabei höchstwahrscheinlich mit satanischer Freude über meine technophoben Mitstreiterinnen amüsieren.

Und weiter gehts mit unserem "Wie tu ich so, als hätte ich eine Ahnung von Genetik in 3 Wochen"-Instantkurs

Die in den vorigen Schritten gewonnene RNA muss nun mit Hilfe der "reversen Transkriptease" (ein Enzym, das eine DNA-Kopie einer RNA anfertigt) in cDNA umgeschrieben werden.

Zu Beginn muss man eine Menge Reagentien herstellen (Phosphatbuffer, Aminoallyl dUTP, Labeling Mix, Cy-dye Ester (Färbungsmittel) und andere Buffer), auf deren Produktion ich nicht eingehe.

Die reverse Transkriptease (kurz RT) baut in den neu synthetisierten cDNA-Strang modifiziertes Uracyl (ersetzt bei cDNA und RNA das Thymin der herkömmlichen DNA), an das später das Cy-dye (der Farbstoff) andocken kann, ein.

Nach der Inkorporation des aa-dUTP (modifiziertes Uracyl) entfernt man die nicht inkorporierten Nukleotide mit Hilfe eines speziellen Buffers. Dabei presst man die mit dem Buffer vermengte Probe immer wieder mit Zentrifugation durch einen Filter, sodass nicht eingebautes aa-dUTP und freie Amine aussortiert werden.

Man trocknet die Probe in einer Vakuum-Zentrifuge und koppelt anschließend die aa-cDNA mit dem Farbstoff.
Den Cy-Farbstoff pipettiert man in die mit einem Buffer vermengte Probe ein und aus und lagert sie anschließend im Dunklen.

Wieder mit einem Buffer entfernt man die nicht eingebauten Farbfragmente.

Jetzt folgt die Hybridisation der Proben, also ihr Auftragen auf den Microarray.

Vor der Hybridisation bereitet man die Microarrays vor, man wäscht sie also mit Wasser und Isopropanol.
Bei dem Färben verwendet man 2 Farbstoffe, rote und blaue. Diese vermengt man jetzt miteinander, trägt sie auf dem Microarray auf und lagert diesen in Alufolie verpackt.

Der Sinn all dieser Tätigkeiten offenbart sich erst später, beim Einscannen der Genchips. Erstens sprengte, erklärte ich jetzt sofort alles, die Beschreibung seinen Rahmen, andererseits bediene ich mich der billigen, aber bewährten Methode, die Erklärung der Hauptsache aufzuschieben, um den sowieso etwas spärlichen Spannungsbogen dieser Dokumentation aufzutunen.

Wie vorgestern geschrieben, sind die von uns isolierten RNAs jämmerlicher Weise unbrauchbar. Es stellte sich heraus, dass die Proben auf Grund von Bakterienbefall so sind. (Zumindest ein kleiner Wermutstropfen, da der Defekt also nicht dem µ-Team zuzuschreiben ist.)

Folglich hantierten wir am heutigen Tag mit Proben aus einem früheren Projekt. Diese enthalten die (NUR-77-)Bakterien, mit denen ein Teil unserer Proben behandelt worden ist, nicht, also werden wir nicht so viele Resultate erlagen wie geplant.

Obwohl das Projekt ein wenig von der Montagsenttäuschung überschattet ist, scheint die Sonne unbeirrt gnadenlos weiter. Wir versuchen, uns ein Beispiel an ihr zu nehmen.

Nachdem Andi gestern dankenswerter Weise die cDNA (in DNA umgeschriebene RNA) aus den früher isolierten RNAs gewonnen und das "Aminoallyl Labeling"-(siehe Forschungsdokumentation) durchgeführt hatte, färbten wir die cDNA mit rotem und blauem Farbstoff, um sie später auf den Microarrays (->Links) erkennen zu können. Sylvia und ich trugen die hybridisierte Probe auf 4 Genchips auf, die jetzt friedlich, in Alufolie eingehüllt die Zeit bis Morgen Früh bei angenehmen 42°C verbringen.

Da unser Projekt aus vorhin geschilderten Gründen ziemlich durcheinandergebracht und in geplanter Weise nicht realisierbar ist, überlegen sich unsere Betreuer einen Plan B, über dessen Details wir bei einer morgigen Sitzung aufgeklärt werden.

Trotz Allem herrscht jetz eine ganz positive Stimmung, alle hoffen, die Kurve kratzen und doch noch in den verbleibenden eineinhalb Wochen ein abgeschlossenes Projekt, das sich sehen lässt, auf die Beine stellen zu können.

Nach dem Ernten der Zellkulturen (->13. 7. 2007) war heute zunächst die Phasenseparation an der Reihe:

Man versetzt die homogene Lösung mit Chloroform, schüttelt sie und zentrifugiert das Gebräu unter Einwirkung von bescheidenen 12000 g.

Nun findet man in der "Epi" drei Phasen: Unten die rote Phenolphase (enthält die DNAs), in der Mitte die schmale Interphase (beinhaltet die Proteine), oben schließlich die wässrige Phase, in der sich die von uns gesuchten RNAs verstecken.

Ganz vorsichtig pipettiert man diese wässrige Phase, sodass ja nichts von den anderen Phasen mitgesaugt wird, in einen frischen Behälter.

Jetzt fällt man die RNAs mit Hilfe von Isopropanol aus dem Wasser heraus, zentrifugiert die Flüssigkeit, sodass sich die RNAs in Form eines weißen Gels, des "Pellets" am Boden der Eprovette ablagern.

Sorgfältig schüttet bzw. pipettiert man die Flüssigkeit ab, ohne dass der Pellet mitrutscht.

Dieser wird mit Ethanol gewaschen, wieder von der Flüssigkeit befreit und getrocknet.

Anschließend hat man die RNA in RNAse-freiem Wasser zu lösen. Die Qualität des Ergebnisses unserer Bemühungen überprüft man mit einem Fotospektrometer beziehungsweise einem Bioanalyser.

Wir, also das "Team µ" bekamen heute die weitere Isolierung von RNA aufgetragen.

Diese direkt an die Arbeit am Freitag anknüpfende Aufgabe bestand eigentlich vor Allem aus Pipettieren, Zentrifugieren und Schütteln von Lösungen, außerdem aus den sich in die Länge ziehenden Wartezeiten, also lauter "Routinearbeiten", wie ich dachte, die keine allzu große Herausforderung darstellen sollten, aber die Schicksalsgöttinnen wollten Sylvia und mich anscheinend eines Besseren belehren.

Der nach der Isolierung als Kontrolle eingesetzte "Bioanalyser" spuckte uns nämlich nicht optimale, ja, unbrauchbare Werte aus.

And again...

Eingeschüchtert aber unbeirrbar tapfer wiederholte man alle Vorgänge, die, wenn auch zu nichts Anderem, so zur Routinegewinnung gut waren. Zu nichts Anderem, da wir bei dem Qualitätsnachweis unserer Arbeit wieder durchfielen.
Also brachte uns die heutige Arbeit auf das gesamte Projekt blickend nicht weiter, ließ uns jedoch crashkursartig in den Trial-and-Error-Alltag des Forschens eintauchen.
Oft hilft es, die Sachverhalte von der positiven Seite zu betrachten... Besser jetzt ebenfalls die negativeren Aspekte des naturwissenschaftlichen Arbeitens kennenlernen als später.

In diesem Sinne freue ich mich auf einen (hoffentlich ergiebigeren) weiteren Verlauf des Projektes am Mittwoch. Hinsichtich des morgigen Tages kam nämlich der für alle vernichtende Befehl von Oben (Dipl.-Ing. Dr.techn., Univ-Prof. Z. Trajanoski), gefälligst Hitzeferien zu halten.
Wie schade.

Allzu große Überraschungen gab es beim Ablauf der Schritte nicht, im Vergleich zu meiner Vorstellung war etwas mehr Präzision und Zügigkeit verlangt.

Man hatte geschwind zu sein, da beispielsweise Trizol, das zur Gewinnung reiner RNA erforderlich ist, für uns Möchtegernforscher giftig ist und den Zellen auch nicht allzu gut tut.

Auf Hygiene mussten wir besonders genau achten, da es hier um das Ernten reinstmöglicher Proteine und RNA ging. Neben dem Tragen der modischen Gummihandschuhen war also Händesäubern mit RNAse (RNA-mampfendes Zeug) angesagt.

Ob wir die Hürden erfolgreich hinter uns brachten, wird sich nächste Woche ergeben. Bericht folgt selbstverständlich.

Heute war es soweit: Der gestern beschriebene Versuchsteil unseres Projektes wurde (tataaaa!) realisiert.

Obwohl sich die Tätigkeit aufgrund eines Grillfestes auf den Vormittag beschränkte, fühle ich mich nach der heutigen Arbeit am erschöpftesten im Vergleich zu den vorigen Tagen.
Laborarbeit ist schon etwas Seltsames... Zugegeben ist das Realisieren einer Versuchsanordnung nicht die intellektuellste Tätigkeit, die man sich vorstellen kann, erfordert jedoch enorme Konzentration und Präzision.

Außerdem ist der Zeitablauf nervenaufreibend, da man nach etwa zehnminütiger aktiver Tätigkeit oft eine halbe bis einer Stunde zu warten hat, bevor es weitergehen kann.

Ohne diesen Herausforderungen wäre die Arbeit natürlich halb so spannend, beklagen kann ich mich also keinesfalls.

Auch wenn es nicht der Fall zu sein scheint: Ich brauche auch Entspannung, deshalb werden meine verehrten Blogleser die bescheidenen Einträge in den nächsten zwei Tagen entbehren müssen. Aber am Montag geht es natürlich weiter.

Allen ein schönes Wochenende!