Ich hatte Glück, denn 10 der 11 Proben für die ich letztens vorbereitet hatte, waren sequenziert worden. Diese, für die T3-Primer verwendet wurde, galt es wieder mit dem Programm SeqMan zu alignen und korrigieren. Zuerst machte ich mich an die ci- und F-templates, da von denen bereits 5 mit T7-Primer analysiert wurden. Zusammen mit meinen frisch-sequenzierten konnte ich bei diesen (ci1, ci2, ci5, F4, F11) komplette, 700bp lange Sequenzen erhalten. Die zwei neuen P-templates (P20, P31) waren von der Sequenz her leider völlig unbrauchbar. Bei den K-Proben( K27, K29 und K35) sah es schon viel besser aus, K29 reichte sogar allein bis über 700bp!
Zumittags hatte ich, da dies mein letzter Tag war, einen Zwetschken/Marillen-Kuchen mitgebracht, über den sich mein gesamtes Team sehr freute. Hier hatte ich auch die Gelegenheit für ein Gruppenfoto.
Es kam jedoch sogar noch besser: Mittlwerweile waren meine letzte Probe und alle 10 Proben von Jutta sequenziert worden. Sogleich konnte ich mich an die Arbeit machen, das zuvor fehlende template P30 zu untersuchen. Es erwies sich auch als gute Sequenz. Dann machte ich mich daran, mit Juttas Proben weiterzumachen. Ich startete gleich mit allen 5 P-templates. Eines war unbrauchbar, jedoch bemerkte ich bald, dass diese neue Aufgabe viel zu anstrengend und zeitraubend war. Deshalb beschränkte ich mich nur auf das am luktrivst-wirkende template. Bei dem stellte sich wunderbarerweise heraus, dass die Sequenz auch 700bp weit reichte, und somit verwendbar wurde.
Alles in allem hatte ich nun 8 templates mit kompletten Sequenzen: ci1, ci2, ci5, F4, F11, P19 (hatte zwar nur ca. 660bp, war aber trotzdem verwendbar), P35 und K29. Also von jedem etwas.
Mine zeigte mir nun nochmal, wie man aus solchen Sequenzen einen phylogenetischen Baum erstllen kann. Dazu brauchte ich noch die Sequenzen von allen anderen Salix-Arten, um meine einordnen zu können. Zusätzlich nahm ich noch eine Popolus-Sequenz, da unser Programm auch eine gattungsfremde Sequenz benötigte. MegAlign fasste zuerst alle Sequenzen zusammen und allignte sie, konnte auch bereits einen Baum darstellen. Wir öffneten dann den neuen File im Programm ClustAl, das uns noch einen schöneren Baum bescherte, den wir auch als Bild speichern konnten.


Das ist nun mein Ergebnis der "Summerschool 2006":

Heute erwartete ich die fertig-sequenzierten Proben P1, P5, K1 und K3. Am Computer konnte ich deren Sequenzen analysiren: Im Programm SeqMan allignte ich jeweils die P und K-Proben mit einem zugehörigem, fertig ausgewertetem template. K1 konnte mit den anderen zwei Sequenzen nicht in Zusammenhang gebracht werden, da die Qualität der Sequenz unzureichend war. Sie war nur 200bp statt üblicherweise über 500bp lang und hatte undeutliche peaks. P1 hingegen reichte sogar bis 700bp, daher war für dieses keine Sequenzierung von der anderen Seite mehr notwendig. Insgesamt entdeckte ich bei P und K viele Polymorphismen (Unterschiede zum template), was in dieser Menge auf Hybridisierung hindeutet.
Morgen werden hoffentlich die restlichen Proben fertig sequenziert sein. Für diese wurde ja T3-Primer verwendet (d.h. Sequenzierung von der anderen Seite). Zusammen mit meinen bisherigen T7-Proben werden sich hoffentlich einige Sequenzen von beiden Seiten überlappen und somit komplett (alle 700bp) auswertbar sein. Von denen erhoffe ich dann einen phylogenetischen Baum zeichnen zu können, welcher die Verwandtschaften der Proben zeigt.

Da bei meiner letzten Plasmid-Isolation drei Viertel meiner Proben schlechte Konzentration aufwiesen, musste ich diese umfällen.
Ich verwendete wieder die PEG-6000 Methode. Diese sollte bereits bekannt sein :). Bei der Gelelektrophorese mit 0,7% Agarose-Gel zeigte sich, dass ich K2, K4 und K5 zum Sequenzieren verwenden konnte.
Für die heutige Sequenzreaktion verwendete ich T3-primer um von der anderen Seite der Sequenz zu lesen. Die Menge des templates kam auf dessen Konzentration an. Bei ci1, ci2, ci5, F4, und F11 (bereits mit T7 sequenziert) nahm ich 1ul , bei K2, K4, K5, P4 2ul und bei P2 und P3 5ul. Dazu kamen 4ul terminal mix, 1ul T3 und Wasser bis insgesamt 20ul. Das PCR-Programm war wieder einmal BigDye.
Nachdem die 2,5h abgelaufen waren, fällte ich meine PCR-Produkte nochmals um, um sie von den Primern zu trennen, die das Ergebnis stören würden. Diesmal nicht mit der Hilfe von PEG, sondern mit 3M NaOAc pH 5,2 und EtOH abs. Das am Schluss getrocknete pellet war nun bereit, sequenziert zu werden!

Mine hatte am Sonntag freundlicherweise neue Kolonien zum Wachsen angesetzt, damit ich gleich am Montag mit der Plasmid-Isolation anfangen konnte. Die Arbeit die für diese 18 Kolonien, 10 neue und 8, die noch keine guten Ergebnisse geliefert hatten, bevorstand, durfte ich mir jedoch mit Jutta, auch Mitglied der MTH-group, teilen: Ich machte die alten, sie die neuen.
Die Plasmid-Isolation lief soweit nach Plan ab, genauso wie der Verdau. Inzwischen gab es Palatschinken-Party!!! Vielen Dank an Verena Köhler für diesen kulinarischen Höhepunkt des Tages.
Nach dem Verdau luden Jutta und ich unsere Proben auf Gel, wobei sich erstmals Unterschiede unserer Vorgehensweise zeigten: Jutta machte hier alles eher nach Gefühl, ich auf den ul genau. Wie sich dann aber bei der UV-Licht -Auswertung zeigte, war ihre Methode um einiges erfolgreicher: bei ihr konnten alle (!) Proben zum Sequenzieren verwendten werden, bei mir nur zwei, was auch daran lag, dass ich zwei Gels mit verschieden großen Taschen verwenden musste und ich wegen der Umstellung einige Patzer machte.
Ich muss am Mittwoch dann meine Proben nochmals umfällen, um die Konzentration, die für eine PCR nötig ist, zu erreichen.

Heute war es an der Zeit, einen weiteren Versuch mit denjenigen Proben durchzuführen, mit denen es bis jetzt noch nicht geklappt hatte. Dazu zählten: ci9, F7, [ci4, ci5, F1: diese wurden zwar gerade sequenziert, aber das Ergebnis ist sehr ungewiss], P2, P3, P4, K2, K4, K5.
Um bessere Ergebnisse zu erzielen, mussten wir die Konzentration erhöhen, ein klarer Fall für eine Umfällungsaktion. Dieses Mal versuchten wir eine PEG-Umfällung.
Ich hatte von den meisten Proben 40ul, daher gab ich 4ul 3M NaOAc pH 5,2 (10:1), dann 44ul 30% PEG-6000, das ich vorher vorbereitet hatte (1:1) hinzu. Von ci4, ci5 und F1 hatte ich nur 15ul daher nahm ich 1,5ul NaOAc und 16,5ul PEG. Alle tubes wurden gemischt und 15min auf Eis gestellt. Danach lief die PEG-Umfällung wie jede andere auch ab (siehe gestern). Danach löste ich das getrocknete pellet in 40ul TE-Buffer auf, und fing damit an, meine DNA auf frisch zubereitetes 0,7% Agarose-Gel zu laden (2ul template, 4ul loading buffer). In der Auswertung zeigten ci4, F1, P2, P3, P4, K2 und K4.
Inzwischen waren meine früheren Proben fertig sequenziert worden: ci1, ci2, F3, F4, F11, ci4, ci5 und F1. Es wurde Zeit, diese bioinformatisch auszuwerten!!! Mine machte mich wieder mit den Grundlagen vertraut und dann konnte ich schon beginnen, auszuwerten. Gute Sequenzen hatten: ci1, ci2, ci5, F4 und F11. Diese waren praktisch ident mit den samples, die ich zum Vergleich hatte. Die restlichen 3 Sequenzen konnte man nicht auswerten, da wahrscheinlich zuviel RNA- oder E.coli-Reste vorhanden waren. Trotzdem ein sehr gutes Ergebnis.
Am Ende des Tages zogen Mine und ich ein Resumee, wie es gerade um meine Proben stand:

ci1: Sequenz gut
ci2: Sequenz gut
ci4: Sequenz schlecht, jetzige Konzentration gut
ci5: Sequenz gut
ci9: schlechte Konzentration

F1: Sequenz schlecht, jetzige Konzentration gut
F3: Sequenz schlecht, jetzige Konzentration gut
F4: Sequenz gut
F7: schlechte Konzentration
F11: Sequenz gut

P1: sequenziert, nicht ausgewertet
P2: schlechte Konzentration
P3: schlechte Konzentration
P4: schlechte Konzentration
P5: sequenziert, nicht ausgewertet

K1: sequenziert, nicht ausgewertet
K2: schlechte Konzentration
K3: sequenziert, nicht ausgewertet
K4: schlechte Konzentration
K5: schlechte Konzentration

Heute ging es daran, die templates P1, P5m K1 und K3 PCR-bereit zu machen. Wie dies funktioniert steht bereits bei Tag 7. Verwendet wurden: 4ul terminal mix, 1ul T7-buffer, 1ul meiner templates, 14ul Wasser. Das PCR-Programm war BigDye und dauerte 2,5h.
Anschließend fällte ich meine PCR-Produkte um: In 1,5ml tubes bereitete ich 2ul 3M NaOAc pH5,2 und 50ul absoluten EtOHs. Dazu gab ich dann meine templates, mixte und inkubierte 20min auf Eis. Nach 30min Zentrifuge bei 4°C entfernte ich den Überstand komplett (sehr wichtig!) und wusch das pellet mit 500ul 70% Ethanol (kurz vortexen, dann 10min Zentrifuge). Danach verabschiedete ich mich vom Überstand und trocknete das pellet im Vacuum-dryer, um es für die nächsten Operationen bereit zu machen.

Über Nacht waren meine neuen Kolonien herangewachsen: ich beschriftete sie mit P1-5 und K1-5. Mit diesen Stand wieder eine Plasmid-Isolation auf dem Programm. Wie diese funktioniert, könnt ihr in früheren Blog-Einträgen nachlesen. Danach ein 2-stündiger Verdau, für den das gleiche gilt.
Als ich die verdauten und unverdauten Plasmide, nun auf Gel geladen, der Elektrophorese überließ, konnte ich damit beginnen, meine PCR-Produkte (Tag Sieben) umzufällen, also von Primern, etc. befreien. Der Ablauf war der gleiche wie vorgestern (siehe Sechster Tag), außer dass ich zu Beginn nur die Hälfte 3M NaOAC pH 5,2 und 95% EtOH brauchte. Während ich meine Umfällungskandidaten 15min auf Eis inkubierte, konnte ich inzwischen die Ergebnisse der Plasmid-Isolation und des Verdaus bei UV-Licht analysieren. Es stellte sich heraus, dass die Konzentration bei vier Proben (P1, P5, K1, K3) ausreichend war, um sequenziert zu werden.



Nach diesem erfreulichem Ergebnis vollendete ich die Umfällung und durfte endlich (2h nach normalem Dienstende, genause wie in den letzen zwei Tagen) nach Hause gehen.

Die sieben Kolonien, die ich beim letzten Mal verschmähen musste, waren bereit für eine weitere Plasmid-Isolation. Der genaue Ablauf kann in früheren Blogs nachgelesen werden, jedoch war ich schon viel gewandter in meinen Tätigkeiten (Übung macht den Meister). Mittendrin redete ich mit Prof. Marie-Theres Hauser über meine bisherige Arbeit, perfekte Protokollierung und auf was man bei der Plasmid-Isolation genau achten muss, um bestmöglich Ergebnisse zu erzielen. Wegen dieses Gespräches ließ ich meine Proben einmal statt 10min ganze 30min auf Eis liegen, was aber keinen großen Unterschied machte. Der folgende Verdau lief komplett nach Plan ab. Während meine Plasmide nun 2h bei 37°C von den fleißigen Enzymen zerschnitten wurden, bereitete ich neues 1% Agarose-Gel, da keines mehr übrig war. Dieses wurde dann auch sofort für die Gel-Elektrophorese verwendet. Die Ergebnisse waren jedoch überwältigend: 5 von 7 konnten sequenziert werden!!! Genau darauf hatte ich seit dem gestrigen Misserfolg gewartet.



Mit den 3 Ansätzen, die durch Umfällen gestern auch PCR tauglich gemacht wurden, hatte ich somit 8 Plasmide, für die ich eine Sequenzreakiton starten konnte. Das PCR-Programm hieß BigDye, dafür gab es den passenden Terminal-Mix bereits in Tubes . Generell setzt sich die Sequenzreaktion aus 4ul Terminal-Mix, 1ul Ansatz, 1ul 3pM Primer (bei 100uM Stocks) und 14ul Wasser zusammen. Daher bereitete ich für meine 5 neu isolierten Plasmide (zur Sicherheit wie für sechs Proben) 6ul Primer (in meinem Fall T7) und 84ul Wasser. Davon kam in jede der 5 Tubes 4ul Terminal-Mix 15ul, dann wurde 1ul der jeweiligen Templates hinzugefügt. Bei den drei anderen musste die Konzentration erhöht werden, daher war 5ul Template geeigneter. Um 20ul insgesamt nicht zu überschreiten nahm ich nur 10ul Wasser. Als alles vorbereitet war, konnte ich meine Proben in die PCR-Maschine verabschieden.
Spät am Abend startete ich diesmal komplett neue Kolonien (je 5 aus "Parkplatz" und "K") und ließ sie, wie gewohnt, über Nacht in der Brutkammer.