Heute war nicht so viel los. Interessant war die Führung durch die Tierhaltung mit 4500 Mäusen und ein paar wenigen Kaninchen. Ebenso wie in den anderen Abteilungen des Labors wird auch hier am Fettstoffwechsel geforscht, eben an Mäusen. Diese Abteilung ist im Keller des Gebäudes und unterliegt sehr strengen Sicherheitsvorschriften; arbeiten mit den Ratten ist nur in OP-Kleidung erlaubt. Ebenso wie bei Hefe ist es möglich bestimmte Gene auszuknocken, in dem das gewünschte Gen (bei den Mäusen findet dieser Prozess in den Stammzellen des Embryos statt) durch ein Gen ausgetauscht wird, dass Resistenz gegen ein Antibiotikum verleiht, dadurch wird eine Selektion ermöglicht. An den lebenden Mäusen werden kaum Versuche unternommen, nach dem To werden die Organe aus Fettablagerungen untersucht.
Morgen gibts wieder eine neue Transformation, außerdem untersuchen wir bereits transformierte Hefezellen unter dem Mikroskop, durch die Plasmide produzieren sie das Enzym FLARE, ein fluoriszierendes Molekül, dass unter einem Lasermikroskop leuchtet. Fotos davon werden bald hochgeladen.

Wie bereits gestern geschrieben, können haploide Hefezellen verschmelzen und diploide Zygoten bilden. Heute galt es diese von den haploiden Zellen zu trennen. Dazu benutzten wir ein spezielles Mikroskop mit integriertem Bildschirm und einer kleinen Pipette, dünner als eine Stecknadel. Auf einer Nährplatte müssen nun die Zygoten gefunden werden (sie sind länglicher als haploide Zellen), und separiert werden, damit sie dort durch Meiose Sporen bilden. Diese Arbeit kostet sehr viel Geduld und verursacht Frust und Augenschmerzen :-)
Außerdem mussten wieder neue Nährmedien gemischt werden (siehe Tag 1), feste und flüssige. Mit den flüssigen Nährmedien werden wir morgen weiter arbeiten, wenn es darum geht, wie sich das Wachstum von Mutanten mit E. Coli-Plasmiden unter Einfluss von Inositol (ein Alkohol) verändert.

Ich habe für den 5. Tag keinen eigenen Beitrag gepostet, weil das Labor so gut wie leer stand aufgrund des Doc Days. Der Doc Day findet einmal pro Semester statt. Diplomanten und Dissertanten stellen hier in Präsentationen und auf Postern (beides auf Englisch) ihre Arbeiten vor. Außerdem wurde extra für uns eine kurze Hausführung organisiert. Der Maschinenraum (Heizung, Elektrik, Wasserdeionisierung etc.) ist imposant, Bilder folgen bald.

Neben einer neuen Transformation (siehe Tag 3) haben wir zusammen mit Flo eine PCR (englisch für "Polymerase-Ketten-Reaktion") gemacht (oder zumindest versucht...). Bei der PCR geht es darum, bestimmte DNA-Sequenzen mit Primern zu markieren, damit diese dann durch das Enzym Polymerase vervielfältigt werden. Ziel war es, mit dieser kopierten DNA nachzuweisen, ob es sich bei den Hefezellen um haploide oder diploide Hefezellen handelt. Hefe ist ansich haploid (hat also nur einen Chromosonensatz, alle Mehrzeller haben zwei, einen von Vater, einen von Mutter). Jedoch gibt es bei Hefe zwei sogenannte Mating-Typs: a und Alpha. Die Mating-Typs kann man sich wie Geschlechter vorstellen - a verschmilzt nur mit Alpha. Die so entstehnde Zelle besitzt einen diploiden Chromosonensatz.
Zurück zur PCR:
Durch das Enzym Zymolyase wird die Zellwand aufgelöst, die Proben werden inkubiert bei 95°C. Bei dieser Temperatur werden die Proteine zerstört, es bleibt die DNA übrig. Dazu kommt der Primermix, hauptsächlich bestehend aus Wasser, einem pH-Buffer, dNTP, 2-3 Primers und Taq Polymerase. Dieses Gemisch wird dann mit einem programmierbaren Gerät 25 mal zuerst auf 92°C dann auf 55°C und auf 72°C erhitzt, nach diesen 25 Intervallen wird auf 4°C gekühlt.
Was passiert?
Bei 92°C teilen sich die Stränge der DNA.
Bei 55°C lagern sich die Primer an die Stränge an, wobei es immer einen Forward-Primer und einen Revers-Primer gibt, einer pro Strang und Richtung. Die Primer markieren den Abschhnitt der DNA der nun
Bei 72°C beschrieben wird, sprich die Polymerase baut aus dem dNTP die jeweils zum Strang gehörigen Nukleinbasen auf: Adenin zu Thymin, Guanin zu Cytosin und umgekehrt. Die Anzahl der DNA-Sequenzen wächst dabei exponentiell an (2, 4, 8, 16...), daher der Name Kettenreaktion. Mittels eines DNA-Gels (siehe Tag 3) kann nun ermittelt werden, ob das Chromosom haploid oder diploid ist. Der Vorgang dauert 2-3 Stunden, funktioniert hats anscheinend nicht. Flo arbeitet gerade an einer 2. PCR. Morgen gibts dann hoffentlich Resultate.

Das heutige Programm beinhaltete die Extraktion von Lipiden, also Fette, aus geernteten Hefezellen. Die Hefezellen wurden aufgetaut und mit einem Gemisch aus Wasser, Chloroform und Ethanol versetzt. In die Behältnisse kamen außerdem kleine Glaskugeln, Durchmesser ca. 0,5mm. Die Glaskugeln schließen die Zellwand mechanisch auf, die Salze und Proteine lösen sich im Wasser, die Lipide im Chloroform. Aufgrund unterschiedliche Dichte schwimmen diese Schichten nun aufeinander; wässrige Phase über organischer Phase. Die unerwünschte wässrige Phase kann mit einer Vakuumpumpe abgesaugt werden. In der Praxis gestaltet sich das etwas langwieriger, denn mann will ja schließelich das reine Fett haben. Darum mehrmals zentrifugieren, aufs neue mit Chloroform/Methanol versetzen, wieder zentrifugieren etc. Das restliche Chloroform wird dann mit Stickstoff verdampft, Stickstoff deshalb, um Oxidationen der Lipide zu vermeiden. Im Reagenzglas übrig bleiben einige wenige weiße Schlieren: Die Lipide. Doch nicht genug, zur Analyse wollten wir nur spezielle Lipide: Sphingolipide. Bei Sphingolipiden verbindet sich eine Fettsäure über eine Amingruppe (NH) mit einem langen Alkan, dass außerdem noch andere Gruppen enthält (z.B. Hydroxy-Gruppen). Über ein Verfahren, dass sich "Milde alkaline Hydrolyse" nennt zerstört man alle "normalen" Lipide. Natronlauge (NaOH) zerstört die Verbindungen zwischen Glycerol und Fettsäuren, jedoch nicht die NH-Brücke zwischen Sphingosin und Fettsäure. In verschiedenen Proben ließen wir die Reaktion in verschiedenen, viertelstündigen Abständen laufen. Gestoppt wird die Reaktion durch EDTA, dazu kam noch eine Säure um den pH-Wert wieder zu normalisieren. Danach folgte wieder das Extrahieren der Lipide über Wasser/Chloroform/Ethanol wie oben beschrieben und das Abdampfen mit Stickstoff. Am Ende des Tages lösten wir unsere so extrahierten Sphingolipide in Isopropanol und bereiteten sie für die Analyse vor, die nächste Woche abgeschlossen sein wird.

Nun haben die Hefezellen die Coli-Plasmide aufgenommen. Nährmedien beimpft und ab in den Inkubator. Bis Freitag oder spätestens nächste Woche sollten die Kulturen sichtbar sein.
Was war sonst noch? Ich durfte zusehen wie Betreuer Oscar DNA-Gel zubereitete. Hauptbestandteil Ethidiumbromid, daher nicht für Praktikanten geeignet (kanzerogen). Das Ethidiumbromid wird mit Agar geliert und in Form gebracht. Am unteren Ende der Platte werden Proben von Plasmiden (oder linearer DNA) pipettiert. Durch angesetzte elektrische Spannung wird die negativ geladene DNA zum positive Pol durch das Gel gezogen. Die netzartige Struktur des Gels sorgt dabei für eine Aufspaltung nach Größe (ähnlich wie beim Protein-Gel). Ethidiumbromid verankert sich in der DNA, dadurch werden die Stellen, an denen DNA hängen bleibt, sichtbar. Je nachdem, wie weit die DNA durch das Gel gewandert ist, lässt sich die Größe (also die Anzahl der Basenpaare) bestimmen.
Mir wurde außerden ein Einblick in die Kryokammer gewährt. Bei bis zu -80°C werden dort Proben, Proteine und die Hefestämme gelagert.
Die Punktproben vom Vortag zeigten bereits sichtbare Ergebnisse. Ich habe sie eingescannt und die Bilder am Computer abgespeichert. 3 mal alle 24 Stunden ist ein neuer Scan an der Reihe, dann kann man das Wachstum der Mutanten zueinander vergleichen.
Dazu kam heute noch etwas Theorie zu den vielfältigen Arten der Lipide und ihres Aufbaus.

Bin noch bei der Arbeit, die Transformation braucht ihre Zeit:
Für die Transformation muss die Zellwand der Hefe möglichst dünn sein (logarithmische Phase). Die ONCs befinden sich aber mittlerweile in der stationären Phase und haben eine dicke Zellwand. Daher habe ich aus den ONCs neue Kulturen angelegt, allerdings mit einem genau dosierten Verhältniss was die Mikrobenanzahl angeht. Gemessen wird diese mit einem Photometer. Dabei wird ein Lichtstrahl durch die Proben geleitet, je nachdem, wie sehr die Lichtintensität absorbiert wird, kann die Dichte an Zellen festgestellt werden. Die neuen Kulturen wurden noch mal für 4,5 Stunden in den Inkubator verfrachtet. Außerdem kontrollierte ich durch Mikroskopie die Reinheit der Kulturen. Zum Glück fanden sich keine Bakterien oder andere Fremdkörper. Nach den 4,5 Stunden began die eigentliche Transformation. Die Zellwand der Hefe wird durch Lithiumacetat teilweise aufgelöst, dazu kommt noch Wasser, PEG (ein Polymer), Träger-DNA (aus Lachssperma) und eben die am Vortag isolierten Plasmide aus E. Coli. Ähnlich wie die Isolation ist auch die Transformation ein langwieriger Vorgang aus mehrmaligem Pipettieren und Zentrifugieren. Damit bin ich jetzt fertig. Momentan stehen die Epis mit diesem Gemisch im Inkubator bei 42°C; in 5 Minuten gehts weiter...