Benjamin Panzer war im Rahmen der GEN-AU SummerSchool von 3.7. – 28.7.2006 in meinem Labor an der Klinik f. Innere Medizin I, Abt. Hämatologie & Hämostaseologie der MUW.

Herr Panzer zeigte sich sehr interessiert, war engagiert und geschickt bei der Laborarbeit. Er war stets gut gelaunt und kommunikativ, was sich auch in einem guten Einvernehmen mit mit unserer zweiten Gen-AU Schülerin, Frau Krimsky, äußerte. Die beiden führten lebhafte Diskussionen über das gehörte und gemachte, erarbeiteten die Inhalte gemeinsam und verfaßten in Teamarbeit das Protokoll für ihre Projekte.

viele Grüße
Dr. Katrina Vanura
ant

1. DNA Isolierung mit Proteinase K Verdau:

- Ausgangsprodukt: Zellen aus peripherem Blut einer gesunden Person
- 1 x 105 bis 5 x 107 Zellen mit NaCl (physiologische Kochsalzlösung) – damit das Medium in dem sich die Zellen befinden nicht mit der DNA interferiert
- Überstand abheben
- RSB-Puffer (400ml) und RNAse A (1ml) zum Pellet dazugeben à mischen (ohne Vortexer)
- 1 h bei 37 °C inkubieren (damit das Enzym wirkt)
- 400ml TENS-Puffer und 2ml Proteinase K hinzufügen
- auf 37 °C erhitzen – Inkubationszeit mind. 3 h (besser über nacht
- Lösung abkühlen lassen
- Aufreinigen mit 220ml 5M NaCl à gut mischen
- 10 min zetnrifugieren (13 000 U) à Proteinpellet bildet sich
- Überstand mit 2 mal so viel 100% EtOH fällen
- Tubes zentrifugieren (10 min, 13 000 U)
- DNA mit 70 % EtOH waschen, trocknen, lösen
- DNA in H2O geben (Resuspension)
- DNA – Messung der Konzentration im Photometer:
à einfüllen der DNA in eine Quarzbox
à Messung der DNA mit Licht bei einer Wellenlänge von 260nm und 280nm

Benjamin Katja
Ergebnis bei 260nm 0,07 0,48
Ergebnis bei 280nm 0,04 0,27
K= (OD(260) x 50 x Verdünnungsfaktor(20))/1000 70 ng/ml 48ng/ml
Qualität (Optimum = 1,7 – 2) OD (260)/ OD (280) 1,75 1,77

2. PCR

- Agarosegel (Pulver abwiegen – 1%ig), mit Puffer TAEIX mischen und kochen, abkühlen lassen und in einen Trax gießen
- Anfertigen des Lower Mix und des Upper Mix (es werden 2 Tubes gemacht + eine Negativkontrolle/ohne DNA)
- Lower Mix: Wasser mit Puffer, MgCl2, Dntp’s und den 2 Primern mischen
- Wachskügelchen in die Tubes füllen (trennen Lower Mix von Upper Mix)
- erwärmen auf °C
- einfüllen des Upper Mix (H2O, Puffer und Taq – im Falle von HOX11 +
5ml DMSO)
- Inkubieren
- Aufbrechen der Wachsschicht
- Gelkammer mit Puffer auffüllen
- Mix mit Orange G mischen und in die Wells einfüllen
- DNA-ladder-mix in ein Well einfüllen um später die Größe der DNA-Sequenzen messen zu können
- Stromquelle einschalten (man erkennt den Stromfluss anhand von kleinen Luftbläschen) – 30 Zyklen

4’ 94 °C
30’’ 94 °C
30’’ 50 °C
30’’ 72 °C
7’ 72 °C
Hold 4 °C

- Ausrechnen der Größe der DNA-Sequenz (HOX11, LMO2)
- Anschaun des PCR-Produktes unter UV-Licht
- Anhand der Ladder wird die Größe der DNA-Sequenz überprüft

3. GFX Aufreinigung

- Jeweils eine GFX-Säule in 4 Tubes hineingeben
- + 500ml capture buffer (nicht zu dicht an den Filter damit dieser nicht beschädigt wird)
- das PCR-Produkt in die GFX-Säule pipetieren
- Mischen
- Auf 14 000 U, 30s zentrifugieren
- Die Flüssigkeit die sich im Auffangröhrchen befindet weg schütten
- mit 500ml Waschpuffer aufreinigen
- Wieder 14 000 U, 30s zentrifugieren
- Das Auffangröhrchen wegschmeißen
- Die GFX-Säulen in ein 1,5 ml Microzentrifugetube einsetzen
- 50ml Elutionpuffer (H2O) hinzufügen
- Eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren
- Eine Minute bei 14 000 U zentrifugieren

4. Purifikation der DNA von Gelbanden

- DNA-Bande aus dem Agarosegel mittels eines Skalpels ausschneiden
- Das Gewicht des ausgeschnittenen Teilchens herausfinden
- 10 mal so viel capture buffer hinzufügen wie das Gewicht des Gels
- Vortexen und auf 60 °C inkubieren bis das Gel aufgelöst ist (5-15 min.,
zwischendurch vortexen)
- Inhalt in eine GFX-Säule leeren und kurz zentrifugieren
- Eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren
- Wieder 14 000 U, 30s zentrifugieren
- Die Flüssigkeit im Auffangtube wegschmeißen
- mit 500ml Waschpuffer aufreinigen
- Wieder 14 000 U, 30s zentrifugieren
- Das Auffangtube wegschmeißen
- Die GFX-Säulen in ein 1,5 ml Microzentrifugetube einsetzen
- 50ml Elutionpuffer (H2O) hinzufügen
- Eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren
- um die purifizierte DNA zu bekommen zentrifugiert man und frau die
- Lösung 1 Minute lang bei 14 000 U

5. Ligation

- Ligation der PCR Produkte in den Vektor (Plasmid, in unserem Fall E.coli)
- Vector DNA (1ml), insert (7ml), Ligasepuffer (1ml), T4 DNA Ligase (1ml)
- auf 4 °C über Nacht inkubieren

6. Transformation

- Zellen auf Eis auftauen (kommen vom -80er) und immer auf Eis lassen
- 50ml von kompetenten Zellen (E.coli) dazu pepitieren
- Leicht flicken und 20’ auf Eis inkubieren
- Heatschock bei 42 °C exakt 2 min.
- 2 min. auf Eis stellen
- 500ml SOC dazu pipetieren (neben dem Feuer arbeiten da SOC ein Medium ohne Antibiotika ist)
- 1 Stunde auf den Schüttel-Inkubator stellen (37 °C)
- 5’ bei 5 000 U zentirfugieren, 300ml wegschmeißen
- Zellen auf Agarplatten übertragen
- auf 37 °C inkubieren (eine Nacht lang)



1 Dient dazu die Zellwände aufzubrechen
2 dient dazu die Proteine von der DNA zu trennen und aufzuspalten
3 (flüssige) Substanz >Trennen von einzelnen Elementen >Niederschlag in fester Form
4 kompetent = DNA aufnahmefähig

Man extrahiert DNA aus Zellen um mit der reinen Form der DNA arbeiten zu können.
Die wichtigsten Punkte sind:

Ausgangsprodukt – Zellen

· Die Zellen mit PBS (phosphate buffered saline) oder NaCl (physiologische Kochsalzlösung) waschen damit das Medium in welchem die Zellen sind nicht mit der Arbeit mit der DNA interferiert.
· RSB puffer und RNAse dazu geben (dient dazu sie Zellwände auf zu brechen).
· Nach dem Inkubieren, TENS und Proteinase K hinzufügen damit die Proteine aufgespalten werden und wieder inkubieren.
· Abkühlen lassen, wieder NaCl (Aufreinigen) dazu mischen.
· Mit 100% EtOH ausfällen (DNA wird fest)
· Die DNA mit EtOH (70%) waschen und trockenen lassen.
· DNA in Wasser oder Puffer geben (Resuspension).
· DNA – Messung (in welcher Konzentration die DNA vorhanden ist).

Endprodukt – reine DNA

PCR wird gemacht um DNA zu amplifizieren, zu klonen und um nachzusehen, wo sich ein bestimmtes Gen/DNA Sequenz befindet. Zuerst muss man die DNA extrahieren, und einen gewünschten Abschnitt mit Enzymen herausschneiden. Die DNA muss gefärbt werden damit man sie sehen kann und damit sie absinkt. und die Größe verschiedener Abschnitte anhand einenes ``ladders´´ zu messen. Danach muss man die DNA in ``wells`` in Agarosegel hinein pipetieren und eine Stromquelle anschließen. Die DNA wandert jetzt zur Anode.
Unter UV-Licht wird die ``ladder`` und die DNA sichtbar.

ich habe eine PCR vorbereitet und die läuft gerade, ich habe die DNA mit orange-g gemischt und dann in die slots in dem agarose gel hinein pipetiert. dann habe ich die anode und die cathode angeschlossen und den power switch gedrückt ; ) die PCR rennt derzeit und ich suche weiterhin nach infos über das abelson virus und das HTLV. ich werde von nun an auf englisch schreiben da mir dies leichter fällt

nach dem wir mittag gegessen hatten haben wir die DNA in wasser verdünnt. danach haben wir in einem photometer die qualität und die konzentration der DNA gemessen. meine probe hatte die optimale qualität! derzeit suche ich im internet naach infos über das abelson leukemia virus. wenn ich was aufregendes finde poste ich es schon, ich weis doch das ihr fiebert zu erfahren was es mit dem zeugs auf sich hat^^

DNA isoliert (vorstufe der PCR), buffer mit zellen gemischt, mit salz gewaschen, aufpassen dass sich ein pellet der proteine bildet, überstand (der flüssigkeit) abheben,
RSB buffer und RNAse (enzym) dazu geben. proteinase K dazu geben. auf dem heizblock inkubieren (20min 37°C). abkühlen lassen (SDS fällt raus wenns zu kalt ist). lösung wird trüb. NaCl dazu geben. 10 min bei 13000 U zenztrifugieren. DNA mit 100% alk und 70% alk waschen. abpepitieren un trocknen lassen. ist fertig wenn die DNA durchsichtig wird. weiter gehts nach dem mittagessen!

pipetieren geübt, über verschiedene methoden gesprochen, bekanntmachung mit websites mit infos, gelernt verschiedene geräte zu benutzen (vortexer, zentrifugierer, PCR, komisches-heitzkörperding-das-mit-einem-magneten-umrührt
-dessen-namen-ich-vergessen-habe-und-morgen-
nachfragen-werde)

haben bei Dr. Hubmann (?) die theorie des PRC besrochen, und auch teilweise augeführt

bekanntmachung, formalitäten, agarose gel zubereitung, paper beschprechen