Der 29/08/09 war mein letzter Arbeitstag und mein letzter Tag von der schönen Zeit, die ich im Labor hatte.
Wir haben eine PCR mit neuer DNA unserer Mutanten und mit neuen Primern gemacht und ich habe den Kloneverdau ferig gemacht. Auf ein 1,3 prozentiges Agaorsegel habe ich unsere Proben aufgetragen.
Das Gel war ein voller Erfolg. Die allermeisten der Klone hatten die richtige Insertgröße. Bei wenigen hat das Enzym nicht (richtig) geschnitten und wir müssen herausfinden warum (möglicherweise hat die Enzymmenge nicht ausgereicht).
Das wars bald gibts dann meine Labordokumentation Ciao lg Berni

Heute haben wir noch eine PCR gemacht, aber mit neuer DNA von neuen Mutanten und zusätzlich mit derselben DNA wie gestern noch einmal mit Marker 4 da dieser gestern nicht funktioniert hat, ich glaube ich habe das Enzym vergessen.

Jetzt esse ich mal Mittag und mache dann noch einen Restriktionsverdau mit meinen Klonen. Bis dann ciao

Also ich bin fertig, ich habe die PCR von heute morgen aufgetragen und 23 meiner Klone verdaut.

So hab' ich es gemacht:

1. Ich habe die entsprechende Anzahl von Reaktionsgefäßen (PCR-Streifen auf Eis gestellt).

2. Einen Mastermix zubereitet:

Einheit: mikroliter

Pro Reaktion:

steriles Wasser: 16,78
10xbuffer: 2
BSA (bovine serum albumin)*: 0,02
Sfi1: 0,2

Für 25 Reaktionen:

steriles Wasser: 419,5
10xbuffer: 50
BSA (bovine serum albumin)*: 0,5
Sfi1: 5

plasmid DNA (clone), nicht im Mastermix, sondern einzeln dazugeben: 1

Für den Mastermix habe ich jedes der Volumina mit der Anzahl der Reaktionen multipliziert und ca. 10% mehr dazugegeben, damit es ja nicht zu wenig ist, also pro 10 Reaktionen habe ich noch eine extra dazugemischt.

* BSA schützt Enzyme vor schneller Zerstörung wenn diese stark verdünnt sind

WICHTIG: Ich habe alle Flüssigkeiten auf Eis gehalten, da diese sehr empfindlich sind. Das Enzym Sfi1 habe ich als letztes dazu gegeben, da es am empfindlichsten ist.

Danach habe ich den MM (MasterMix) kurz gemischt und zentrifugiert und jeweils 19 mikroliter auf die (auf Eis stehenden) Reaktionsgefäße verteilt.

Zusätzlich habe ich die jeweilige Plasmid DNA (1 Mikroliter) in jedes der Reaktionsgefäße pipettiert.

Zuletzt habe ich die PCR - Reaktionsgefäße in die PCR-Maschine gestellt. Diese läuft 16 Stunden bei 50 Grad Celsius und kühlt dann auf 15 Grad Celsius ab.

Morgen schaue ich mir die DNA Plasmide an, ob sie ungefähr die erwartete Größe haben, wenn ja habe ich vorher als ich sie aus den Bakterien isoliert habe alle richtig gemacht, bzw. die Bakterien habe beim Vermehren alles richtig gemacht =)

Bis morgen ciao

Ah und noch eine Kleinigkeit, ich habe lange Zeit keine Dateien mehr upgeloadet und da es auch mühsam ist jede einzelne Datei downzuloaden stelle ich jetzt ein Zip. Datei mit allen PCR's, Plate Setups,... etc. online. Sie heißt "Alle Dateien" ;) Die Datei zum uploaden war zu groß doch morgen stelle ich eine zum Download bereit, die fast alle Bilder und Dateien beinhaltet

Heute früh habe ich eine PCR gemacht. Doch ich habe andere DNA verwendet als bisher, DNA einer anderen Mutante. Wie immer habe ich drei Kontrollen pro Marker (col, ler, het) gemacht. Ich habe die Marker 3 und 4 verwendet und für jeden von den beiden einen Mastermix mit 52 Reaktionen gemacht, das heißt:

Einheit: mikroliter

10fach buffer 1*52=52
dNTP's 1*52=52
Marker(=Primer1+Primer2) 1*52=52
dh2O 6,45*52=335,4
Taq Polymerase 0,05*52=2,6
DNA 1*52=52

Das Plate Setup werde ich noch online stellen.

Danach habe ich noch 40 Sequenzen von Klonen downgeloadet und mit den Enzymen EcoRI, BamHI und HindIII geschnitten und die Fragmentgrößen berechnet.

Übrigens schreibe ich eine Fachbereichsarbeit in Englisch über das menschliche Genom in der Schule (Research paper about The Human Genome).
Die Laborarbeit hilft mir sehr viel und ich kann mein Wissen aus dem Labor in die Fachbereichsarbeit einbringe.

Auch die Labordokumentation habe ich schon begonnen. Die wichtigsten Methoden habe ich schon eingebracht.

Teile meiner Laboraufzeichnungen habe ich bereits auf Englisch übersetzt und zu meiner Fachbereichsarbeit hinzugefügt.

Bis morgen =) Berni

Heute haben wir MS-Medien zur Kultivierung von Pflanzen gemacht und in Platten gegossen. Auf ihnen haben wir Samen des Ökotypen Columbia und Landsberg sowie Samen eines mutierten Columbia-Ökotypen der 2 Generation auf die Platten aufgetragen. Wir haben alle Marker getestet, haben bereits einige Ergebnisse und wissen nach der nächsten PCR Bescheid, welche Marker neu bestellt werden müssen, weil sie einfach nicht funktioniert haben.
Das Gen, das wir die ganze Zeit über suchen liegt soweit wie die Ergebnisse bis jetzt vorliegen wahrscheinlich auf dem linken Arm des ersten oder zweiten Chromosomes.
Bis zum Ende weiß ich es noch genauer =)

Heute habe ich das Gel von Freitag aufgetragen. Die Ergebnisse sind gut und ich werde sie bald wieder online stellen.

Ich habe die Excelliste der Klone fertig gestellt und fast alle mit Enzymen geschnitten und die Größe der Fragmente berechnet.
Zusätzlich habe ich begonnen meine Labordokumentation zu schreiben.

Bis morgen Berni