Heute war leider mein letzter Tag am Institut. In der Früh pipettierte ich noch die Makrophagen mit den T-Lymphozyten in Tubes, um sie im Hauptgebäude untersuchen zu lassen. Wir nahmen auch noch die restlichen Proben von gestern mit, bei denen auch noch eine Konzentrationsmessung anstand.
Im Hauptgebäude nahm dann die Messung der Zellen mittels Durchflußzytometers gute 2 Stunden in Anspruch.
Danach stellte ich noch die Excel-Tabelle mit den, mittlerweile aus dem Hauptgebäude eingetroffenen, Ergebnissen fertig. Anschließend musste ich noch meine IdentyCard abgeben, und dnaach ging's ans verabschieden. Ich hab' mich mit allen wirklich gut verstanden, und hätte mir die drei Wochen Praktikum nicht interesaanter und spannender erträumen können.

Danach wurden die Tubes mit 200 ?l aufgefüllt und gevortext. Danach wurde die Proben in geeignete Eprouvetten transferiert, die für die folgende Konzentrationsmessung durch einen Roboter geeignet waren. Wir brachten die Hälfte der Proben ins Hauptgebäude, und gingen anschließend gleich Mittagessen. Am Nachmittag erstellte ich dann eine Excel-Tabelle für die spätere Auswertung der Konzentrationen.
Danach ging’s an das eigentliche Highlight des heutigen Tages: Ich durfte mit den von mir isolierten Zellen ein Fluoreszenzexperiment durchführen.
Um dieses Experiment erfolgreich durchzuführen musste ich besonders rasch und trotzdem sehr sauber und genau arbeiten. Zuerst mussten die T-Lymphozyten abzentrifugiert werden. Thomas hatte sie bereits am Abend des Vortages mit einem Fluoreszenzmittel bearbeitet.
In der Zwischenzeit hatte ich wenige Minuten Zeit um die benötigten Mengen an Medium vorzubereiten und eine Vorverdünnung des PPCI herzustellen. Während den 10 Min. des Zentrifugierens musste ich auch noch das Medium bei den Makrophagen mit dem Kompressor absaugen -steril natürlich. Danach wurden o,5 ml pro Well vorgelegt, je nachdem, entweder mit PPCI oder ohne. Danach wurden die T-Lymphozyten resuspendiert, und zu den Makrophagen hinzugefügt. Danach fühlte ich mich wie ein Chirurg nach seiner ersten Operation am offenen Herzen. Doch es hatte alles geklappt, und so konnte ich um 18.00 nach Hause aufbrechen.

In der Früh ging ich mit Thomas ins Hauptgebäude um die ELISA auszuwerten. Leider waren die Ergebnisse alles andere als überragend, was aber laut Thomas und Herrn DDr. Binder nicht an mir, sondern an der Maschine lag, die angeblich des Öfteren „Stimmungsschwankungen“ hatte. das bestätigte sich auch als wir die Werte der Standards auswerteten und die zwar nicht perfekt, aber doch ziemlich genau waren.

Am frühen Nachmittag begann ich dann noch 20 Aliquote des FBS herzustellen und diese durch inkubieren bei 56 Grad Celsius mittels Hitze zu inaktivieren.
Im Anschluss war es meine Aufgabe eine Stimulation der T-Lymphozyten durchzuführen. Dazu wurden sie erstmal in 15 ml Tubes transferiert, und danach abzentrifugiert. Wie bereits am Vortag wurde das Medium abgesaugt und danach wurden die Zellen mittels neuem Medium resuspendiert. Danach wurde eine Vorverdünnung des Stimulantiums hergestellt und in die Wells in die zuvor die resuspendierten T-Lymphozyten pipettiert wurden, hinzugefügt. Allerdings wurden zur Kontrolle auch zwei Wells nicht stimuliert.
Gegen 17.00 Uhr begann ich auch noch zwei Flaschen Zellmedium RPMI mit FBS. Hepes und einem Antibiotika zusammenzumischen. Arbeitsschluss: 18.00 Uhr.

Heute ging ich mit Thomas ins Mäusehas um dort einige Stämme die bereits in der achten Generation sind zu katalogisieren und die Cages mittels entsprechender Karten zu beschriften. Danach wurden die Mäuse von zwei Würfen nach Geschlechtern getrennt, damit sie sich nicht unkontrolliert vermehren konnten, und es so zu Inzucht kommen würde. Von den Mäusen wurden auch gleich Gewebeproben zur Genotypisierung entnommen. Danach eliminierten wir zwei Mäuse, die wir zur späteren Zellgewinnung brauchten. Diese wurden, nachdem wir wieder im Labor angekommen waren, gleich seziert um Makrophagen und T-Lymphozyten zu gewinnen. Danach war ich fünf Stunden damit beschäftigt die Zellen zu zählen, sie abzuzentrifugieren und sie danach in Wells zu setzen. Außerdem musste immer wieder das Medium gewechselt werden.
Im Anschluss trug ich gegen 18.00 Uhr auch noch die ausständigen Standards auf die ELISA-Platten auf.

Thomas war heute nicht da , daher habe ich wieder mit David mitgearbeitet. Gleich in der Früh begann ich verschiedene PBS-Verdünnungen für David herzustellen, was für mich mittlerweile so etwas wie Routinearbeit geworden ist.
Danach begann ich unter dem sterilen „Hood“ (Das ist eine sterile Arbeitsplattform, wo man vor einer Glasscheibe arbeitet, und nur mit den Händen unten durchgreifen kann. Zusätzlich ist ein spezielles Lüftungssystem und antibakterielles UV-Licht in diese Anlage integriert.) zu arbeiten
Dort begann ich die ELISA-Platten mit Proteinen und Antikörpern zu coaten.
Danach half ich Arvand wieder beim Spotmatchen seiner 2D-Gele.
Wie in den letzten Tagen auch, endete mein Arbeitstag gegen 18.30, und nicht wie im Vertrag gefordert um 14.00. Doch weil ich mich anscheinend halbwegs geschickt anstelle, bekomme ich immer wieder Arbeitsaufträge und habe daher alle Hände voll zu tun.

Dies war mit Abstand der coolste Tag bisher. Ich durfte den ganzen Tag ohne jegliche fremde Hilfe selbstständig arbeiten, und dass trotz komplizierter Vorgänge alles funktionierte ,gab den Forschern, die mir mittlerweile einiges an Vertrauen schenken recht.

Heute kam gleich in der Früh Thomas zu mir und bedankte sich bei mir für die Durchführung der BCA. Und mit meinen guten Werten der Vortage als Begründung durfte ich eine weitere BCA mit 15 Samples, die gerade per Post aus den USA gekommen waren, durchführen. Gegen Mittag war ich mit der Bestimmung der Proteinkonzentration fertig, und nach dem Mittagessen in der Mensa erklärte mir Thomas den weiteren Ablauf des Experimentes. Es war am Nachmittag meine Aufgabe eine Verdünnungsreihe für die Samples aufzustellen und danach ELISA-Platten damit zu coaten. Gegen 17.30 hatte ich dann 90 Tubes vor mir stehen, die alle mittels Mulitstepper auf die Platten aufgetragen werden mussten. Arbeitsschluss 19.00 Uhr.

In der Früh begann ich, mit Arvand die am Vortag eingescannten Gele auszuwerten. Dazu verwendeten wir ein spezielles Computerprogramm der Fa. BioRad. Dieses ist auf das auswerten von 2-D Gelen zugeschnitten. Es vergleicht die beiden Gele, in dem es sie übereinander legt, und danach die so genannten Spots, die auffällige Veränderungen in Form und Intensität aufweisen, herausfiltert. So kann man dann Unterschiede der Proteine im pH-Wert, und in Folge auch in der Ladung feststellen.

Arvand wird dann die Gele mittels eines Silverstainings färben, und danach die für ihn interessanten Spots herausschneiden. Danach können die Proteinen mittels verschiedener Methoden wieder aus dem Gel herausgewaschen werden, um sie danach noch genauer auf ihre spezifischen Eigenschaften untersucht werden.

Danach wurde ich noch von Thomas gebeten für ihn einen sehr wichtigen BCA Assay durchzuführen, weil er die Werte der Proteinkonzentrationen brauchte. Also führte ich noch selbstständig diese Bestimmungsmethode für Proteine durch.

Gleich in der Früh durfte ich alleine meinen ersten BCA Assay durchführen. Ich besprach mit David noch einmal genau den Vorgang, und danach konnte ich diese Methode der Proteinquantifizierung bereits völlig selbstständig durchführen. Noch dazu verwendete ich die Standards, die ich in der Woche zuvor für David hergestellt hatte. Nicht gerade die besten Voraussetzungen für ein gutes Ergebnis...
Im Anschluss ging’s wieder einmal in die Mensa zum Mittagessen, und danach durfte ich Arvand ins Hauptgebäude des AKHs zum Scannen seiner 2D-Gele begleiten.
Mithilfe dieser zwei Dimensionen kann man nämlich sowohl, ähnlich wie bei Polyacrylamid-Gelen die Proteine nach Größe aufsplitten, aber auch die Änderung des pH-Wertes ablesen. Die Gele wurden in einem Scanner eingelesen, und danach digital gespeichert. Anschließend machte ich mich auf den Heimweg, weil es wie in den Tagen zuvor bereits nach 18:00 war. Doch auch heute war es wieder ein äußerst spannender Tag an dem ich viel Neues erfahren durfte.

Heute waren die zwei Leiter der Forschungsabteilung; Herr DDr. Harald Esterbauer, und Herr DDr. Christoph Binder wieder im Labor, und deshalb fand heute um 12.00 Uhr auch wieder ein LabMeeting statt, bei dem die Ergebnisse diskutiert wurden, und neue Forschungsziele festgesetzt wurden. Da drei ausländische Forscherinnen anwesend waren, wurde, wie auch während sämtlichen gemeinsamen Mittagessen in der Mensa, Englisch gesprochen, was die Sache für mich nicht unbedingt leichter machte, aber ich konnte dem Verlauf der Diskussionen gut folgen, auch wenn ich nicht immer alles Verstand, weil mir das wissenschaftliche Hintergrundwissen und das englische Fachvokabular fehlte.
Gegen 14.00 gingen wir in die Mensa essen und hatten wieder mal eine Menge Spaß, aber natürlich auf Englisch!
Dann schaute ich noch Thomas zu, wie er Proteine mit Antigenen und Antikörpern „bearbeitete“, und Laura erklärte mir, wie sie verschiedene Organe einfärbt und in Parafin eingießt, um danach hauchdünne Schnitte herzustellen. So kann dann zum Beispiel die Struktur der Lunge unter dem Mikroskop untersucht werden.

In der Früh durfte ich in der Abteilung für Diagnostik bei der Isolierung von RNA zuschauen. Hier wird die RNA in einen Shredder gegeben, der am unteren Ende einen Filter enthält, und dann noch zusätzlich in einem Tube steckt. Dann wird die RNA mit mehreren Puffern gewaschen und danach jeweils abzentrifugiert. So wird die RNA von unerwünschten Zellen getrennt.

Weiters durfte ich noch meine Elektrophorese, die ich am Vortag begonnen hatte fertig stellen. David hatte am Abend noch die Proteinproben aufgetragen und so konnte ich am Freitag bereits mit dem Silverstaining beginnen.

Heute durfte ich erstmals mit David zusammenarbeiten. Er hat zwar eigentlich Humanbiologie studiert, hat dann allerdings auf Molekularbiologie umgesattelt, und ist deshalb ebenfalls in der Forschungsgruppe um DDr. Binder tätig. Wir verstehen uns sehr gut, weil er auch Klavier spielt, und er mir gegenüber immer sehr freundlich und geduldig ist. Außerdem sind er, und seine Kollegen Thomas und Arvand allgemein sehr heitere junge Forscher, die gerne ein bisschen spaßen.

Wie alle in der Forschungsgruppe um Herrn Dr. Binder forscht auch er an Arteriosklerose, wenn auch nur am Rande. Er untersucht nämlich im Moment die Eigenschaften von B1-Zellen, deren Antikörper und Proteine, die mit Arteriosklerose in Zusammenhang gebracht werden.

Wir führten eine Polyacrylamid-Elektrophorese, genauer gesagt eine SDS-PAGE (Abkürzung für engl. sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) durch, und bestimmten anschließend auch, durch die Verwendung von Proteinstandards, die Anzahl der Proteine.
Danach bot mir David an, für ihn neue Proteinstandards zusammen zu pipettieren, was ich natürlich gerne machte. Dazu wurde aus einem so genannten Stock, einer Grundlösung, eine Verdünnungsreihe aufgestellt, in dem durch ständiges weiter pipettieren einer bestimmten Menge, eine sinkende Proteinkonzentration entsteht. Aus diesen Werten lässt sich später eine Standardkurve errechnen. Arbeitsende: ca. 17.00 Uhr.

10.00 Uhr: Einführung in die Aufgaben und Forschungsgebiete des Institutes für medizinische und chemische Labordiagnostik durch Frau Mag. Maria Oszsvar weil sich mein Betreuer Herr Dr. Harald Esterbauer derzeit auf Urlaub befindet.
Danach wird mir von Frau Mag. Oszvar noch einmal der genaue Ablauf der Polymerasen Kettenreaktion und der im Anschluss durchgeführten Elektrophorese erläutert. Danach besuchte ich noch mit Johannes. einem Molekularbiologiestudent das Mäusehaus. Dort half ich beim Earmarken, und bei der Probenentnahme.

Der heutige Tag war eher ruhiger. Ich konnte mit Frau Mag. Oszvar noch einmal das Ergebnis der gestrigen PCR diskutieren und danach beim Sezieren der Mäuse zusehen. Aus diesen Tieren wird versucht Plasma und B1-Zellen zu gewinnen. Vor allem die B1-Zellen interessieren die Forscher weil noch kaum etwas über die Eigenschaften dieses Typs bekannt ist. Dazu wurden die Zellen mithilfe eines mikroskopisch kleinen Rasters gezählt, und danach wurde hochgerechnet: Endergebnis 72 Mill. Zellen in 2 ml Flüssigkeit. Danach wurden diese mithilfe verschiedener Antigen-Antikörper Reaktionen sortiert: heraus kamen 5 Mill. B1-Zellen, die für die weitere Forschung interessant waren.

Heute durfte ich meine erste PCR selbstständig durchführen. Ich hatte zwar das erste Mal Laborgeräte dieser Art in der Hand, habe mich allerdings laut meiner Betreuerin Frau Mag Oszvar recht geschickt angestellt, was auch das spätere Ergebnis bestätigte.

Ich mischte mir meinen eigenen MasterMix, wobei die Polymerase aufgrund ihrer Temperaturempfindlichkeit zuletzt hinzugefügt wurde, und nachdem ich die Stripes penibel beschriftet hatte, begannen wir die DNA und den MasterMix zusammen zu pipettieren. Danach wurden die Stripes in den Thermocycler gegeben, wo die bereits erwähnten Zyklen mehrmals ablaufen, und in der Zwischenzeit hatte ich Zeit mit David einem Jungforscher des Instituts Bekanntschaft zu machen.

Danach wurde ein Agarosegel gegossen, zu dem auch Ethidium Bromid (mutagen) hinzugefügt wurde, weil sich dieses in der DNA einlagert und ein Fluoreszenzstoff ist. So kann die DNA später lokalisiert werden.

Im nächsten Schritt wurden die Kämme aus dem Gel herausgenommen und das Gel in ein Becken gestellt. Dort wurde dieses mit einer Pufferlösung bedeckt und unter eine Spannung von ~120 Volt gesetzt.

Eine Stunde später war die DNA aufgrund ihrer negativen Ladung rRichtung Plus-Pol gewandert und konnte dann im UV Licht Photographiert werden.


Protokoll für IL-5 7. 8. 2007

Genotypisierung durch PCR

PCR MasterMix für IL-5

5x Buffer 5 ?l
dNTP 0,25 ?l
PrimerMix 1 ?l
go Taq (Polym.) 0,125?l
Aqua bidest 17,6 ?l
MM gesamt 24 ?l
DNA 1 ?l
Total 25 ?l



Ergebnis:

number of mouse: IL-5
56 +/+ Homozygot
57 +/- Heterozygot
58 +/- Heterozygot
59 -/- Knock-out (hoz)
60 -/- Knock-out (hoz)
61 +/+ Homozygot
62 +/- Heterozygot
n ok
Co ok