Bevor ich mit den Mäusen arbeiten darf, bekomme ich einen sterilen Ganzkörperanzug mit Atemschutzmaske, Handschuhen, speziellen Schuhen und allem was dazu gehört. Anschließend werde ich noch einmal in einer Luftschleuse sterilisiert um nun gänzlich rein drei Stockwerke unter der Erde mit den Mäusen arbeiten zu können. Neu gezüchtete Mäuse müssen markiert werden und ihre DNA muss extrahiert werden. Ich markiere sie, indem ich mit einem Locher Markierungen an verschiedene Stellen in ihre Ohren stanze. Mit dem heraus gestanzten Gewebe habe ich gleichzeitig ihre DNA extrahiert. Ansonsten schneiden wir hierzu ein Stück der relativ unempfindlichen Schwanzspitze ab. In einem bestimmten Mittel (Proteinase K in DNA-lysis Buffer), welches Verena hinzugibt löst sich über Nacht die reine DNA aus dem Gewebe. Diese Mäuse sind konditionelle RANK-Knockout-Mäuse, welche wir zu einer Cre-Linie gekreuzt haben und jetzt wollen wir ihre DNA vervielfältigen um sie anschließend mit der Gelelektrophorese zu analysieren um ihre Genotypen zu bestimmen. Bei einem konditionellen Knockout werden im Gegensatz zum konventionellen Knockout nicht alle Zellen von Geburt an verändert, sondern nur zu einem Bestimmten Zeitpunkt oder an einem bestimmten Ort. Das können wir festlegen, indem man einen Promoter verwendet. Wir wollten zum Beispiel nur das Brustgewebe der weiblichen Mäuse verändern und haben deswegen einen Promoter namens MMTV verwendet. Er wird während der Pubertät aktiv, also dann wenn sich das Brustgewebe entwickelt.

Cre/loxP Methode: Wenn man ein Gen oder eine bestimmte Sequenz der DNA gezielt ausschalten möchte, so wird diese Sequenz zuerst gefloxt. Das heißt man setzt so genannte loxP Stellen zu Beginn und am Ende der Sequenz. loxP ist eine bestimmte Sequenz die von Cre (ein Enzym) erkannt werden kann. Cre schneidet die DNA Sequenz inklusive der beiden loxP Stellen heraus und verbindet die Sequenz entweder zu einem Ringförmigen Konstrukt, welches dann abgebaut wird, oder deaktiviert die Sequenz indem es sie einfach umdreht und damit ist ihre Funktion deaktiviert. Das ist von der Richtung der loxP Sequenzen abhängig. Aber da das Cre-Enzym nur in bestimmten Bakterien vorkommt, muss es erst in die DNA der Versuchstiere gebracht werden, indem man Vorgänge der „zufälligen Integration“ ausnützt. Diese Tiere gehören dann also zu den transgenen Tieren, da sie ein Gen enthalten das ursprünglich von einem anderen Organismus stammt (dem Bakterium). Das floxen funktioniert auch ähnlich, und zwar mit Hilfe der „homologen Rekombination“. Die genaue Erklärung der komplexen Prozesse der Rekombination wird mir Verena morgen geben.

Hier noch ein Link zu einer Skizze zu Cre/loxP von Wikipedia:
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b7/CreLoxP_Modellversuch.png

PCR: Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) ist eine Methode, die angewandt wird um DNA im Labor zu vervielfältigen. Wir haben also unsere DNA-Lösung und geben nun verschiedene Primer hinzu. Einen Primer kann man sich als kurzes Stück DNA vorstellen, welches an einem bestimmten Abschnitt der zu vervielfältigenden DNA bindet und bildet einen Startpunkt, an welchem die Polymerase mit ihrer Verknüpfungsreaktion beginnen kann. Polymerasen, oder genauer DNA-Polymerasen, sind Enzyme, die als Katalysator für die Synthese von den Nukleotiden fungieren. Das heißt, sie leiten die Bindung eines Nukleotiden an seinen komplementären ein. Die Nukleotide bestehen aus Phosphor, Zucker und einer Nukleobase, also Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin oder Uracil. Da die meisten Polymerasen sehr temperaturempfindlich und damit nicht für PCR geeignet sind, verwenden wir eine spezielle Polymerase, die Taq-Polymerase. Taq steht für Thermus Aquaticus, ein Bakterium, welches in heißen Quellen lebt und entsprechend hitzebeständig ist – in diesem wurde genanntes Enzym entdeckt. Zusätzlich zu der DNA, den Primern, den Nukleotiden und der Polymerase kommt noch eine Pufferlösung. Anschließend kann die PCR beginnen. Die Reaktionsgefäße werden in den Heizblock gestellt und das Programm startet. Nachdem der Heizblock aufgeheizt wurde, wiederholt sich jetzt ein Zyklus von drei Schritten beliebig oft. Der erste Schritt wird als Denaturieren bezeichnet. Die DNA wird auf knapp 100° Celsius erhitzt und trennt sich dabei in ihre beiden Einzelstränge auf – sie „schmilzt“. Im zweiten Schritt (Primer-annealing) binden die Primer bei einer bestimmten Temperatur (50 – 60 °C) an die aufgetrennten Stränge. Im dritten Schritt (Elongation, circa 70° C) kommt die DNA-Polymerase zum Einsatz und bindet die Nukleotide an die getrennten Stränge, beginnend bei den Primern, welche die Anfangssequenz des neuen Strangs bilden. Jetzt hat sich die gewählte vorhandene DNA-Sequenz verdoppelt und vervielfältigt sich also exponentiell.

Mein Betreuer ist Verena Sigl, eine Studentin die am IMBA (Institute for Molecular Biotechnology) ihre Diplomarbeit schreibt. Mit ihr werde ich an einem Protein namens RANK (Receptor Activator of NF-κB) in der Gruppe von Prof. Dr. Josef Penninger arbeiten. NF-κB ist ein Protein, welches die Transkription (RNA-Synthese) beeinflussen kann, ein so genannter Transkriptionsfaktor. Ich habe ein Mail erhalten in dem Verena die bisher bekannten Funktionen von RANK erklärt: RANK ist ein Rezeptor und wird über seinen Liganden RANKL aktiviert. Danach kommt es zu verschiedenen Signalkaskaden, deren Verlauf Situationsabhängig ist. Das für RANK kodierende Gen wurde früher als Schlüsselgen für den Knochenauf und -abbau beschrieben. Die Aktivität von RANK ist notwendig, damit Osteoclasten, jene Zellen, die für den Knochenabbau zuständig sind, richtig gebildet werden und heranreifen können. Ist RANK also defekt oder funktioniert eine andere Komponente der Signalkaskade nicht mehr, kann kein Knochenabbau mehr stattfinden. RANK- und RANKL-Knockout-Mäuse leiden daher unter schwerer Osteopetrose.

Knockout-Maus: Das Ziel der Herstellung von Knockout-Mäusen ist es, ein bestimmtes Gen einer Maus gezielt zu deaktivieren. Dazu werden vorerst Chimären hergestellt. Das passiert indem man gentechnisch veränderte embryonale Stammzellen, in welchen das betreffende Gen inaktiviert wurde, in einen Embryo injiziert wird und dieser ausgetragen wird. Die Zellen der resultierenden chimärischen Maus haben sich also entweder aus den natürlichen oder aus den veränderten Stammzellen entwickelt, das heißt jede Zelle trägt entweder veränderte oder unveränderte DNA in sich – ebenso die Keimzellen. Jetzt werden die Chimären mit Wildtypen rückgekreuzt. Verschmilzt jetzt eine veränderte Keimzelle der chimärischen Maus mit einer Wildtyp-Keimzelle, erhalten wir heterozygote Tiere, jede ihrer Zellen trägt sowohl das veränderte, als auch das unveränderte Gen in sich. Die Heterozygoten werden wiederum miteinander gekreuzt um homozygote Mäuse zu erhalten. In ihnen wurde das Gen vollständig ausgeknockt.





Eine weitere Funktion von RANK wurde erst kürzlich herausgefunden: Wenn RANK- oder RANKL-Knockout-Mäuse (also Mäuse deren RANK-Gen gentechnisch inaktiv gemacht wurde) Junge bekommen, dann sterben diese aufgrund der nicht funktionierenden Milchproduktion der Mutter. RANK ist also auch notwendig, damit in der Schwangerschaft aus dem Brustepithel Strukturen zur Milchproduktion entstehen können. Ein weiteres Gen, welches hierbei von RANK in der Signalkaskade aktiviert wird ist Cyclin D1. Man weiß, dass es nötig ist um die Proliferation von Zellen voranzutreiben, das heißt die Gewebevermehrung also Zellteilung. Und da RANK also die Expression von Cyclin D1 beeinflusst, vermutet man, dass es bei der Entstehung von Mammakarzinomen eine Rolle spielt. Ob das wirklich so ist, gilt es nun herauszufinden, und genau das versuchen wir.