Wir wollen überprüfen, ob ein bestimmtes Konstrukt in Transgenen Mäusen so funktioniert wie wir es erwarten. Es ist ein MMTV-RANK-IRES-Cre-Konstrukt (MMTV RIC). IRES ist eine Internal Ribosomal Entry Site. Nach der Transkription in mRNA kommen Ribosomen zum Einsatz, welche die Translation von mRNA zu Proteinen ermöglichen. IRES ist eine einfach eine „Anlaufstelle“ zwischen den beiden Sequenzen (RANK, Cre) für die Ribosomen um eine vollständige Translation der gesamten mRNA zu garantieren, da die Sequenz (RANK und Cre) insgesamt sehr lange ist. Mit Kreuzungen aus Mäusen mit diesem Konstrukt (Zum Beispiel RANK fl/Δ mit MMTV RIC) würde also folgendes passieren: Einerseits schneidet Cre das RANK-floxed-Allel heraus und damit wäre es eine Δ/Δ-Maus, also eine Knockout-Maus, aber in RIC haben wir ja auch noch eine neue transgene RANK Sequenz, welche durch MMTV expremiert wird. Vielleicht kompensieren sich die beiden Effekte? Das könnten wir zum Beispiel mit diesen Mäusen untersuchen. Zuerst müssen wir einige MMTV RIC Mäuse und Wildtypen als Kontrolle töten. Das machen wir mit der CO2-Kammer (mit Trockeneis), weil wenn wir ihnen das Genick brechen würden, könnten Organe beschädigt werden.

Wir wollen untersuchen, in welchen Organen RANK wie stark expremiert wurde. Dazu schneide ich Lunge, Herz, Leber, Thymus, Milz, Niere, Hoden/Uterus, Lymphknoten und Leber heraus und sie kommen in kleine beschriftete Plastikboxen:



Über Nacht kommen die Gewebe in eine Maschine, die das in den Organen enthaltene Wasser langsam gegen reinen Alkohol austauscht. Jetzt sind die Gewebe bereit, in Paraffin eingebettet zu werden. Eigentlich ganz leicht: Flüssiges Paraffin kommt in eine vorbereitete Kammer und diese wird auf eine gekühlte Platte gestellt. Nachdem sich die unterste Schicht Paraffin verfestigt hat, gebe ich das Gewebe hinein und nach einer Stunde kühlen ist der Paraffinblock mit dem Gewebe bereit geschnitten zu werden. Vuk aus dem Histolab hat mich extra eine Stunde das Schneiden gelehrt, da ich sonst nicht alleine arbeiten darf (Gefahr sich an den Klingen zu verletzen etc.). Aber die richtigen Schnitte unserer Gewebe werden wir erst morgen machen. Anschließend werden wir ein Staining auf Cre und RANK machen, ich bin schon gespannt…

Die letzte Woche war den Zellen und Mäusen gewidmet. Zuerst das spannende Ergebnis der Zellen: Offensichtlich beeinflusst die Anwesenheit von RANKL die Proliferation verschiedener Zelllinien in unterschiedlicher Weise. Nachdem ich meine Daten ausgewertet hatte, ergab sich folgendes Diagramm:



Gezeigt wird die Zelldichte (10E4 Zellen/ml) verschiedener Zelllinien am vierten Tag unseres Experiments. Die blauen Balken beschreiben die Zelldichte jeder Zelllinie in „normalem“ Medium, die roten Balken beschreiben die Zelldichte jeder Zelllinie in Medium mit dem RANKL Protein. MEC und MCF-10α sind humane Epithelzelllinien. MCF-7, MDA und SKBR3 sind humane Cancer-Epithelzelllinien, das heißt, sie sind bereits mutiert und wurden also einem Tumor entnommen. Wie sich herausgestellt hat, ist bei MEC und MCF-7 kein Unterschied zwischen Zellen mit- beziehungsweise ohne RANKL festzustellen. Bei den drei übrigen Zelllinien hingegen vermehren sich RANKL-Zellen offensichtlich wesentlich schneller und nach vier Tagen haben wir zum Beispiel bei SKBR3 schon dreimal so viele Zellen wie bei derselben Zelllinie ohne RANKL. Aber warum beeinflusst RANKL bestimmte Zellen mehr als andere? RANKL bindet ja an RANK, was wiederum ein Rezeptor ist (Receptor Activator of NF-κB), also wäre eine sinnvolle Schlussfolgerung, dass SKBR3 Zellen vielleicht einfach mehr RANK-Rezeptoren haben als zum Beispiel MEC-Zellen. Dazu werde ich dann Daniel fragen, für den ich das Experiment durchgeführt hat. Weil wir schöne Ergebnisse bekommen haben, habe ich auch gleich ein weiteres RANKL-Experiment für diese Woche mit anderen Zelllinien vorbereitet.