Bernhard's Lab Log

Von der Maus zum Gewebeschnitt

2009-08-26T17:16:53Z

Wir wollen überprüfen, ob ein bestimmtes Konstrukt in Transgenen Mäusen so funktioniert wie wir es erwarten. Es ist ein MMTV-RANK-IRES-Cre-Konstrukt (MMTV RIC). IRES ist eine Internal Ribosomal Entry Site. Nach der Transkription in mRNA kommen Ribosomen zum Einsatz, welche die Translation von mRNA zu Proteinen ermöglichen. IRES ist eine einfach eine „Anlaufstelle“ zwischen den beiden Sequenzen (RANK, Cre) für die Ribosomen um eine vollständige Translation der gesamten mRNA zu garantieren, da die Sequenz (RANK und Cre) insgesamt sehr lange ist. Mit Kreuzungen aus Mäusen mit diesem Konstrukt (Zum Beispiel RANK fl/Δ mit MMTV RIC) würde also folgendes passieren: Einerseits schneidet Cre das RANK-floxed-Allel heraus und damit wäre es eine Δ/Δ-Maus, also eine Knockout-Maus, aber in RIC haben wir ja auch noch eine neue transgene RANK Sequenz, welche durch MMTV expremiert wird. Vielleicht kompensieren sich die beiden Effekte? Das könnten wir zum Beispiel mit diesen Mäusen untersuchen. Zuerst müssen wir einige MMTV RIC Mäuse und Wildtypen als Kontrolle töten. Das machen wir mit der CO2-Kammer (mit Trockeneis), weil wenn wir ihnen das Genick brechen würden, könnten Organe beschädigt werden.

Wir wollen untersuchen, in welchen Organen RANK wie stark expremiert wurde. Dazu schneide ich Lunge, Herz, Leber, Thymus, Milz, Niere, Hoden/Uterus, Lymphknoten und Leber heraus und sie kommen in kleine beschriftete Plastikboxen:

Über Nacht kommen die Gewebe in eine Maschine, die das in den Organen enthaltene Wasser langsam gegen reinen Alkohol austauscht. Jetzt sind die Gewebe bereit, in Paraffin eingebettet zu werden. Eigentlich ganz leicht: Flüssiges Paraffin kommt in eine vorbereitete Kammer und diese wird auf eine gekühlte Platte gestellt. Nachdem sich die unterste Schicht Paraffin verfestigt hat, gebe ich das Gewebe hinein und nach einer Stunde kühlen ist der Paraffinblock mit dem Gewebe bereit geschnitten zu werden. Vuk aus dem Histolab hat mich extra eine Stunde das Schneiden gelehrt, da ich sonst nicht alleine arbeiten darf (Gefahr sich an den Klingen zu verletzen etc.). Aber die richtigen Schnitte unserer Gewebe werden wir erst morgen machen. Anschließend werden wir ein Staining auf Cre und RANK machen, ich bin schon gespannt…

Ergebnisse: Zellwachstum unter RANKL-Einfluss

2009-08-26T17:08:28Z

Die letzte Woche war den Zellen und Mäusen gewidmet. Zuerst das spannende Ergebnis der Zellen: Offensichtlich beeinflusst die Anwesenheit von RANKL die Proliferation verschiedener Zelllinien in unterschiedlicher Weise. Nachdem ich meine Daten ausgewertet hatte, ergab sich folgendes Diagramm:

Gezeigt wird die Zelldichte (10E4 Zellen/ml) verschiedener Zelllinien am vierten Tag unseres Experiments. Die blauen Balken beschreiben die Zelldichte jeder Zelllinie in „normalem“ Medium, die roten Balken beschreiben die Zelldichte jeder Zelllinie in Medium mit dem RANKL Protein. MEC und MCF-10α sind humane Epithelzelllinien. MCF-7, MDA und SKBR3 sind humane Cancer-Epithelzelllinien, das heißt, sie sind bereits mutiert und wurden also einem Tumor entnommen. Wie sich herausgestellt hat, ist bei MEC und MCF-7 kein Unterschied zwischen Zellen mit- beziehungsweise ohne RANKL festzustellen. Bei den drei übrigen Zelllinien hingegen vermehren sich RANKL-Zellen offensichtlich wesentlich schneller und nach vier Tagen haben wir zum Beispiel bei SKBR3 schon dreimal so viele Zellen wie bei derselben Zelllinie ohne RANKL. Aber warum beeinflusst RANKL bestimmte Zellen mehr als andere? RANKL bindet ja an RANK, was wiederum ein Rezeptor ist (Receptor Activator of NF-κB), also wäre eine sinnvolle Schlussfolgerung, dass SKBR3 Zellen vielleicht einfach mehr RANK-Rezeptoren haben als zum Beispiel MEC-Zellen. Dazu werde ich dann Daniel fragen, für den ich das Experiment durchgeführt hat. Weil wir schöne Ergebnisse bekommen haben, habe ich auch gleich ein weiteres RANKL-Experiment für diese Woche mit anderen Zelllinien vorbereitet.

Wachstumskurven und RANKL Einfluss auf Proliferation

2009-08-17T19:48:26Z

Wachstumskurven von Zellen: Ein weiterer Aspekt, den wir von RANK (bzw. RANKL) untersuchen wollen, ist dessen Einfluss auf das Zellwachstum, also wie oft sich Zellen in einer bestimmten Zeit teilen. Weil uns RANK im Zusammenhang mit dem Brustgewebe interessiert verwenden wir die Zelllinie MCF-10α. MCF-10α-Zellen sind humane Epithelzellen aus den Brustdrüsen. Um eine Zelllinie zu erhalten müssen die Zellen regelmäßig „gesplittet“ werden, da sie sich ja ständig vermehren und sie irgendwann aufgrund von Platz- und Nährstoffmangel sterben würden. Weil die Zellen am Boden unserer „Dishes“ haften, saugen wir das Medium einfach ab, waschen den Rest mit PBS und geben auf die Zellschicht etwas Trypsin. Trypsin löst die Zellen vom Boden und erlaubt uns dann, die Zellen und die Flüssigkeit (Medium, Trypsin) voneinander durch zentrifugieren zu trennen. Jetzt kann ein Teil der Zellen resuspendiert werden und hat damit genug Platz um weiter zu leben. Weil ich jetzt die Zellen zählen will, löse ich sie wie beim Splitten mit Trypsin von den Dishes, entnehme einen kleinen Teil (circa 10µl) und untersuche die Dichte der Zellen unter dem Mikroskop, indem ich sie auf eine „Zählplatte“ gebe. Die feinen Linien auf der Platte machen ein schnelles Zählen auf einer kleinen vorgegeben Fläche möglich und so kann man die Zelldichte leicht hochrechnen. In dem Bild habe ich die eher schwer erkennbaren Linien mit roter Farbe angedeutet.

Jetzt muss ich jeden Tag die recht langwierige Arbeit des Zählens verrichten und darf auf ein verwertbares Ergebnis hoffen. Wenn ich mir das richtig überlegt habe, sollte sehr wohl ein Unterschied feststellbar sein, da ja auch Cyclin D1 in die Signalkaskade von RANK involviert ist. Und weil dieses maßgeblich an der Proliferation der Zellen beteiligt ist gehe ich davon aus, dass Zellen, die mit RANKL stimuliert werden, sich schneller vermehren, als Zellen ohne RANKL. Das Ergebnis werden wir am Ende der Woche sehen!

Stammzellen für Knockouts - Homologe Rekombination

2009-08-16T21:42:46Z

Heute hat mir Verena endlich den Prozess der homologen Rekombination erklärt: Jede Zelle hat natürlich sowohl einen paternalen, als auch einen maternalen DNA-Doppelstrang, also einen Teil der Mutter und einen Teil des Vaters. Die homologe Rekombination passiert normalerweise während der Meiose. Einer der beiden Doppelstränge bricht auf und es kommt zu einem so genannten Crossing-over. Ich habe versucht in PowerPoint eine Skizze dazu zu zeichnen:

Nehmen wir an, der maternale Strang (rot) sei unterbrochen (1). Bestimmte Enzyme (glaube ich – werde ich nochmal nachlesen) kommen jetzt zum Einsatz, die die beiden Stränge noch weiter abbauen, aber in die jeweils entgegengesetzte Richtung (2). Ein weiteres Enzym kommt zum Einsatz und trennt den anderen Doppelstrang (blau) auf. Das gibt einem roten Strangarm die Möglichkeit, sich in die entstandene Schlaufe „einzufädeln“ und dort mit den komplementären Basen zu binden (3). Weil sich die beiden Stränge sehr ähnlich sein müssen, damit sie richtig binden, nennt man es „homologe“ Rekombination. Jetzt kommt wieder unsere Polymerase ins Spiel und ergänzt den fehlenden Strang – aber mit dem jeweils anderen Strang, da ja auch dort die Strangarme gebunden haben (4). Wenn alles Fehlende ergänzt wurde, hat nun ein weiteres Enzym, die Fähigkeit, DNA an bestimmten Stellen zu schneiden. Und genau das tut es dann auch (5). Jetzt haben wir wieder zwei vollständige Stränge, jedoch mit einigen Austäuschen (6). Es gibt auch noch andere Stellen, an denen die Stränge wieder zerschnitten werden können um so andere Kombinationen am Ende zu erhalten. Diese Prinzipien nützt man auch aus, um zum Beispiel embryonale Stammzellen zu verändern (Für Knockout-Mäuse, et cetera). Das heißt man schleust eine Sequenz mittels Elektroporation (Zellmembran wird kurzzeitig permeabel) in eine Zelle und diese legt sich dann an die bestehende DNA an und es kommt zur homologen Rekombination. In der Regel wird eines der jeweiligen Exons deaktiviert (überschrieben etc.) um ein Gen inaktiv zu machen, also um es auszuknocken. Weil homologe Rekombination keineswegs immer stattfindet, nachdem man die fremde Sequenz eingeschleust hat, sondern auch zum Beispiel die zufällige Integration (die Sequenz integriert sich an zufälliger Stelle) stattfinden könnte, beinhaltet ebendiese Sequenz auch positiv- oder negativ-Marker. Zum Beispiel werden Zellen gegen Antibiotika resistent, wenn die Sequenz an der richtigen Stelle eingebaut wurde, oder sie zerstören sich selbst durch Toxine, wenn sie an der falschen Stelle eingebaut wurden. Da ich nächste Woche mit Arabella arbeiten werde und sie sich mit solchen Dingen beschäftigt (glaube ich) werde ich dann sicher mehr dazu sagen können.

Genotypen bestimmen [edit]

2009-08-16T21:09:33Z

Ich habe hier nur meinen alten Beitrag überarbeitet (Bilder, bessere Erklärung) und nochmal geposted, also:

Gelelektrophorese: Die Gelelektrophorese ist eine Methode um die Größe von DNA-Strängen zu analysieren. Damit können wir zum Beispiel die Genotypen unserer Versuchstiere bestimmen, das heißt, wir untersuchen zum Beispiel, was für Genotypen aus unseren Kreuzungen hervorgegangen sind. Wir stellen uns also ein Agarosegel her indem wir Agarose in einem Puffer aufkochen und Ethidiumbromid als Farbstoff hinzugeben. Ethidiumbromid lagert sich in die DNA ein und mach sie dann unter UV-Licht sichtbar. Das Gel verfestigt sich mit einem „Kamm“ in einer Kammer. Unsere mit PCR vervielfältigte DNA wird noch mit einem weiteren Farbstoff versehen und wird in die durch die Zähne des Kamms entstandenen kleinen Kammern im Gel hinein pipettiert. Das Gel ist jetzt in einer mit Elektroden versehenen Wanne, welche wiederum mit einem Puffer gefüllt wird. Anschließend lege ich eine Gleichspannung von circa 140 Volt an. Weil DNA negativ geladen ist zieht es sie durch das Gel in Richtung der Anode und je größer die Sequenz, desto langsamer kann sie sich durch das Gel bewegen. Betrachten wir nach einiger Zeit (20 – 30 min) unser Gel unter UV-Licht ergeben sich zum Beispiel solche Bilder:

Betrachten wir den Ausschnitt genauer: Im oberen Teil des Bildes erkennen wir die Kammern von denen aus die DNA hinunter, das heißt in Richtung Anode, gelaufen ist. Betrachten wir also die verschiedenen Spalten (von links nach rechts): In die erste Kammer habe ich eine so genannte DNA-Ladder gegeben. Sie beinhaltet beliebige Sequenzen zu 100, 200, 300, … 1000 Basenpaaren. Die unterste Bande war die Sequenz mit 100 Bp, die zweite von unten die Sequenz mit 200 Bp und so weiter. Das Interessante kommt aber erst jetzt: Die nächste Spalte ist das erste richtige Ergebnis! Wir haben hier versucht, das für RANK zuständige Gen mittel Cre/loxP zu eliminieren. Jetzt können wir also die Genotypen unterscheiden indem wir zwischen einer wildtyp-, einer gefloxten und einer Δ-Sequenz (vollständig deletiert) differenzieren. Verena erklärt, dass die Wildtypen die kürzesten, die gefloxten Mäuse die mittellangen und die Δ-Tiere die längsten Sequenzen haben. Für unsere Analyse bedeutet es also folgendes: In der ersten Spalte finden wir zwei Banden, eine auf oberer Höhe (circa 600 Bp, siehe DNA-Ladder; entspricht Δ) und eine auf mittlerer Höhe (circa 400 Bp, siehe DNA-Ladder; entspricht floxed). Merke: Das Tier Nr 1 ist also ein Heterozygote und zwar fl/Δ (floxed-Delta). Nr 2 wäre dann ein Homozygot fl/fl (floxed-floxed), Nr 3 wie Nr 1, Nr 4 fl/+ (floxed-plus), Nr 5 Δ/+ (Delta-plus) und so weiter. Das „+“ steht für Wildtyp. Bei Nummer sieben hat anscheinend die PCR nicht funktioniert und die beide letzten Spalten sind Kontrollspalten, von denen wir wissen, dass sie fl/Δ beziehungsweise fl/+ sind. Für alle weiteren Versuche und Züchtungen und Kreuzungen müssen wir den Genotyp natürlich immer genau wissen. Eine Sache ist mir jedoch während Verenas Erklärungen aufgefallen: Wie kann es sein, dass eine Δ-Sequenz größer ist als eine wildtyp? Wie kann es sein, dass eine Sequenz, die nicht mehr da ist (außer den Primern natürlich), größer ist, als eine die eben schon noch da ist? Das ganz funktioniert anscheinend so (Ich habe versucht eine Skizze in PowerPoint zu zeichnen):

Ich habe eine Sequenz, genauer: bestimmte „Exons“, also jene DNA-Sequenzen, die für die Proteine zuständig sind, der „wesentliche Teil“ könnte man auch sagen. Der andere Teil der DNA sind so genannte Introns, aber sie sind noch relativ unerforscht und wurden bis vor kurzem noch für Müll gehalten. Inzwischen nimmt man an, dass sie Regulatoren für bestimmte Prozesse sind. Jedenfalls habe ich zum Beispiel meine für RANK zuständigen Exons (blaue Balken, siehe Skizze). Ich setzte die ersten beiden Primer VOR diese Exons. Das heißt, eigentlich vervielfältigen wir im PCR nicht einmal das Gen selbst sondern nur ein kurzes Stück DNA, von dem wir dann auf den Genotyp rückschließen können. Unsere insgesamt drei Primer (grüne Pfeile) sind also wie auf der Skizze zu sehen gesetzt. Bei einem Wildtyp würde jetzt die vermehrte DNA, genau die Sequenz zwischen forward- und erstem reverse-Primer sein. Der dritte Primer ist NACH den Exons gesetzt und damit viel zu weit weg für die Polymerase. Bei dem gefloxten Tier haben wir eine loxP-Stelle (rot) genau in der Sequenz zwischen den ersten beiden Primern und damit ist die von PCR vervielfältigte Sequenz genau um die Größe einer loxP-Stelle größer. Der dritte Primer kommt erst bei Delta ins Spiel. Hier wurde unser Gen bereits mittels Cre/loxP eliminiert und alles was übriggeblieben ist, ist nur eine loxP-Stelle. Auch die Sequenz, an der normal der zweite Primer binden hätte können, ist weg. Was uns bleibt, ist eine Sequenz zwischen dem ersten und dem dritten Primer, welcher nun auch in Reichweite ist. Dass diese Sequenz die längste ist, ist aber zufällig in unserem Fall so, und nur auf die Primerwahl zurückzuführen. So kann Delta durchaus auch größer als floxed oder wildtype sein.

Tote Mäuse, ein Pathologe und seltsamer Krebs...

2009-08-11T22:18:07Z

Ich habe jetzt auch die Methoden der Reverse Transkriptase-Polmerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und der Real-Time-Quantitative-PCR (qRT-PCR) kennengelernt: Die qRT-PCR unterscheidet sich im Grunde nicht viel von der PCR, nur wird hier eben „real time“ mit gemessen, wie schnell die Kettenreaktion stattfindet. Daraus kann man sich dann die Genexpression, also die Aktivität eines Gens ausrechnen.
RT-PCR stellt aus mRNA cDNA her und funktioniert ähnlich wie PCR, jedoch ist eine viel aufwändigere und genauere Vorarbeit zu leisten. Die genaue Prozedur werde ich erklären, wenn ich das Verfahren noch einmal wiederholt habe, um sicherzugehen.

Weitere Arbeit mit Mäusen: Noch am Freitag haben wir RANK-Knockout-Mäusen Hormonpellets unter die Haut gesteckt. Das Ganze ist recht einfach: Man gibt ihnen eine Betäubungsspritze in den Bauch, rasiert und desinfiziert sie und schneidet sie vorsichtig auf und schiebt das Pellet mit einer Pinzette unter die Haut. Anschließend wird die Wunde mit einer Metallklammer zugeklammert und fertig. Die Pellets, die wir verwendet haben enthalten das Hormon Progesteron. Progesteron wurde zum Beispiel Frauen in den Wechseljahren gegen Beschwerden verschrieben und plötzlich stieg die Zahl von Brustkrebsdiagnosen erheblich. Als man mit Progesteronbehandlungen wieder aufgehört hatte, ist auch die Anzahl der Brustkrebserkrankungen zurückgegangen. Wir vermuten, dass Progesteron mit RANK zusammenhängt, also RANK stark stimuliert und deswegen früher Brustkrebs ausbricht. Diese Mäuse haben wir jetzt getötet und wollen ihre RANKL- und RANK-Expressionen untersuchen. Das Töten geht schnell und einfach: Die Tiere kommen in ein CO2 Kammer und ersticken. Mit Nadeln fixiert man sie auf einer mit Alufolie überzogenen Korkplatte und das „Mäuse-Zerlegen“, wie es Daniel (er arbeitet auch an RANK) liebevoll ausgedrückt hat beginnt. Vorsichtig löst man also das Brustgewebe heraus und entnimmt der toten Maus noch etwas Blut.

Heute untersuchen wir aber das Gewebe von RANK-Knockoutmäusen mit großen Tumoren, oder besser: wir lassen untersuchen. Dazu fahren wir zum AKH Wien zu Lukas, einem Pathologen, den ich zufällig schon länger persönlich kenne. Leider konnte er uns aber noch keine eindeutigen Auskünfte geben weil er noch weitere Schnitte braucht, deswegen werden wir kommenden Freitag noch einmal vorbeischauen. Außerdem hat Lukas seltsame untypische „Verhornungen“ im Krebs entdeckt und wir wissen noch nicht genau was das bedeutet. Es bleibt also spannend!

Ich bin übrigens nicht der einzige Summerschool Praktikant am IMBA. David Chromy arbeitet im selben Lab wie ich und nebenan sollen noch zwei weitere Schüler sein, die ich aber noch nicht kennengelernt habe. Und seit heute habe ich endlich das Buch "Molecular Biology of the Cell" von Alberts! Da werden die Methoden nochmals sehr detailliert beschrieben. Ein super Buch!

Erste Arbeit mit Mäusen, PCR und Cre/loxP-Methode

2009-08-10T21:19:17Z

Bevor ich mit den Mäusen arbeiten darf, bekomme ich einen sterilen Ganzkörperanzug mit Atemschutzmaske, Handschuhen, speziellen Schuhen und allem was dazu gehört. Anschließend werde ich noch einmal in einer Luftschleuse sterilisiert um nun gänzlich rein drei Stockwerke unter der Erde mit den Mäusen arbeiten zu können. Neu gezüchtete Mäuse müssen markiert werden und ihre DNA muss extrahiert werden. Ich markiere sie, indem ich mit einem Locher Markierungen an verschiedene Stellen in ihre Ohren stanze. Mit dem heraus gestanzten Gewebe habe ich gleichzeitig ihre DNA extrahiert. Ansonsten schneiden wir hierzu ein Stück der relativ unempfindlichen Schwanzspitze ab. In einem bestimmten Mittel (Proteinase K in DNA-lysis Buffer), welches Verena hinzugibt löst sich über Nacht die reine DNA aus dem Gewebe. Diese Mäuse sind konditionelle RANK-Knockout-Mäuse, welche wir zu einer Cre-Linie gekreuzt haben und jetzt wollen wir ihre DNA vervielfältigen um sie anschließend mit der Gelelektrophorese zu analysieren um ihre Genotypen zu bestimmen. Bei einem konditionellen Knockout werden im Gegensatz zum konventionellen Knockout nicht alle Zellen von Geburt an verändert, sondern nur zu einem Bestimmten Zeitpunkt oder an einem bestimmten Ort. Das können wir festlegen, indem man einen Promoter verwendet. Wir wollten zum Beispiel nur das Brustgewebe der weiblichen Mäuse verändern und haben deswegen einen Promoter namens MMTV verwendet. Er wird während der Pubertät aktiv, also dann wenn sich das Brustgewebe entwickelt.

Cre/loxP Methode: Wenn man ein Gen oder eine bestimmte Sequenz der DNA gezielt ausschalten möchte, so wird diese Sequenz zuerst gefloxt. Das heißt man setzt so genannte loxP Stellen zu Beginn und am Ende der Sequenz. loxP ist eine bestimmte Sequenz die von Cre (ein Enzym) erkannt werden kann. Cre schneidet die DNA Sequenz inklusive der beiden loxP Stellen heraus und verbindet die Sequenz entweder zu einem Ringförmigen Konstrukt, welches dann abgebaut wird, oder deaktiviert die Sequenz indem es sie einfach umdreht und damit ist ihre Funktion deaktiviert. Das ist von der Richtung der loxP Sequenzen abhängig. Aber da das Cre-Enzym nur in bestimmten Bakterien vorkommt, muss es erst in die DNA der Versuchstiere gebracht werden, indem man Vorgänge der „zufälligen Integration“ ausnützt. Diese Tiere gehören dann also zu den transgenen Tieren, da sie ein Gen enthalten das ursprünglich von einem anderen Organismus stammt (dem Bakterium). Das floxen funktioniert auch ähnlich, und zwar mit Hilfe der „homologen Rekombination“. Die genaue Erklärung der komplexen Prozesse der Rekombination wird mir Verena morgen geben.

Hier noch ein Link zu einer Skizze zu Cre/loxP von Wikipedia:
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b7/CreLoxP_Modellversuch.png

PCR: Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) ist eine Methode, die angewandt wird um DNA im Labor zu vervielfältigen. Wir haben also unsere DNA-Lösung und geben nun verschiedene Primer hinzu. Einen Primer kann man sich als kurzes Stück DNA vorstellen, welches an einem bestimmten Abschnitt der zu vervielfältigenden DNA bindet und bildet einen Startpunkt, an welchem die Polymerase mit ihrer Verknüpfungsreaktion beginnen kann. Polymerasen, oder genauer DNA-Polymerasen, sind Enzyme, die als Katalysator für die Synthese von den Nukleotiden fungieren. Das heißt, sie leiten die Bindung eines Nukleotiden an seinen komplementären ein. Die Nukleotide bestehen aus Phosphor, Zucker und einer Nukleobase, also Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin oder Uracil. Da die meisten Polymerasen sehr temperaturempfindlich und damit nicht für PCR geeignet sind, verwenden wir eine spezielle Polymerase, die Taq-Polymerase. Taq steht für Thermus Aquaticus, ein Bakterium, welches in heißen Quellen lebt und entsprechend hitzebeständig ist – in diesem wurde genanntes Enzym entdeckt. Zusätzlich zu der DNA, den Primern, den Nukleotiden und der Polymerase kommt noch eine Pufferlösung. Anschließend kann die PCR beginnen. Die Reaktionsgefäße werden in den Heizblock gestellt und das Programm startet. Nachdem der Heizblock aufgeheizt wurde, wiederholt sich jetzt ein Zyklus von drei Schritten beliebig oft. Der erste Schritt wird als Denaturieren bezeichnet. Die DNA wird auf knapp 100° Celsius erhitzt und trennt sich dabei in ihre beiden Einzelstränge auf – sie „schmilzt“. Im zweiten Schritt (Primer-annealing) binden die Primer bei einer bestimmten Temperatur (50 – 60 °C) an die aufgetrennten Stränge. Im dritten Schritt (Elongation, circa 70° C) kommt die DNA-Polymerase zum Einsatz und bindet die Nukleotide an die getrennten Stränge, beginnend bei den Primern, welche die Anfangssequenz des neuen Strangs bilden. Jetzt hat sich die gewählte vorhandene DNA-Sequenz verdoppelt und vervielfältigt sich also exponentiell.

Die ersten beiden Arbeitstage am IMBA - Was ist RANK?

2009-08-10T12:22:15Z

Mein Betreuer ist Verena Sigl, eine Studentin die am IMBA (Institute for Molecular Biotechnology) ihre Diplomarbeit schreibt. Mit ihr werde ich an einem Protein namens RANK (Receptor Activator of NF-κB) in der Gruppe von Prof. Dr. Josef Penninger arbeiten. NF-κB ist ein Protein, welches die Transkription (RNA-Synthese) beeinflussen kann, ein so genannter Transkriptionsfaktor. Ich habe ein Mail erhalten in dem Verena die bisher bekannten Funktionen von RANK erklärt: RANK ist ein Rezeptor und wird über seinen Liganden RANKL aktiviert. Danach kommt es zu verschiedenen Signalkaskaden, deren Verlauf Situationsabhängig ist. Das für RANK kodierende Gen wurde früher als Schlüsselgen für den Knochenauf und -abbau beschrieben. Die Aktivität von RANK ist notwendig, damit Osteoclasten, jene Zellen, die für den Knochenabbau zuständig sind, richtig gebildet werden und heranreifen können. Ist RANK also defekt oder funktioniert eine andere Komponente der Signalkaskade nicht mehr, kann kein Knochenabbau mehr stattfinden. RANK- und RANKL-Knockout-Mäuse leiden daher unter schwerer Osteopetrose.

Knockout-Maus: Das Ziel der Herstellung von Knockout-Mäusen ist es, ein bestimmtes Gen einer Maus gezielt zu deaktivieren. Dazu werden vorerst Chimären hergestellt. Das passiert indem man gentechnisch veränderte embryonale Stammzellen, in welchen das betreffende Gen inaktiviert wurde, in einen Embryo injiziert wird und dieser ausgetragen wird. Die Zellen der resultierenden chimärischen Maus haben sich also entweder aus den natürlichen oder aus den veränderten Stammzellen entwickelt, das heißt jede Zelle trägt entweder veränderte oder unveränderte DNA in sich – ebenso die Keimzellen. Jetzt werden die Chimären mit Wildtypen rückgekreuzt. Verschmilzt jetzt eine veränderte Keimzelle der chimärischen Maus mit einer Wildtyp-Keimzelle, erhalten wir heterozygote Tiere, jede ihrer Zellen trägt sowohl das veränderte, als auch das unveränderte Gen in sich. Die Heterozygoten werden wiederum miteinander gekreuzt um homozygote Mäuse zu erhalten. In ihnen wurde das Gen vollständig ausgeknockt.

Eine weitere Funktion von RANK wurde erst kürzlich herausgefunden: Wenn RANK- oder RANKL-Knockout-Mäuse (also Mäuse deren RANK-Gen gentechnisch inaktiv gemacht wurde) Junge bekommen, dann sterben diese aufgrund der nicht funktionierenden Milchproduktion der Mutter. RANK ist also auch notwendig, damit in der Schwangerschaft aus dem Brustepithel Strukturen zur Milchproduktion entstehen können. Ein weiteres Gen, welches hierbei von RANK in der Signalkaskade aktiviert wird ist Cyclin D1. Man weiß, dass es nötig ist um die Proliferation von Zellen voranzutreiben, das heißt die Gewebevermehrung also Zellteilung. Und da RANK also die Expression von Cyclin D1 beeinflusst, vermutet man, dass es bei der Entstehung von Mammakarzinomen eine Rolle spielt. Ob das wirklich so ist, gilt es nun herauszufinden, und genau das versuchen wir.

Persönliches / Eindrücke

2009-06-26T08:40:00Z

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Diskussion / Auswertung

2009-06-26T08:40:00Z

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Methoden / Experimente

2009-06-26T08:40:00Z

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Probleme / Aufgaben

2009-06-26T08:40:00Z

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