Genotypen bestimmen [edit]
23:09 / 16.08.2009
Ich habe hier nur meinen alten Beitrag überarbeitet (Bilder, bessere Erklärung) und nochmal geposted, also:
Gelelektrophorese: Die Gelelektrophorese ist eine Methode um die Größe von DNA-Strängen zu analysieren. Damit können wir zum Beispiel die Genotypen unserer Versuchstiere bestimmen, das heißt, wir untersuchen zum Beispiel, was für Genotypen aus unseren Kreuzungen hervorgegangen sind. Wir stellen uns also ein Agarosegel her indem wir Agarose in einem Puffer aufkochen und Ethidiumbromid als Farbstoff hinzugeben. Ethidiumbromid lagert sich in die DNA ein und mach sie dann unter UV-Licht sichtbar. Das Gel verfestigt sich mit einem „Kamm“ in einer Kammer. Unsere mit PCR vervielfältigte DNA wird noch mit einem weiteren Farbstoff versehen und wird in die durch die Zähne des Kamms entstandenen kleinen Kammern im Gel hinein pipettiert. Das Gel ist jetzt in einer mit Elektroden versehenen Wanne, welche wiederum mit einem Puffer gefüllt wird. Anschließend lege ich eine Gleichspannung von circa 140 Volt an. Weil DNA negativ geladen ist zieht es sie durch das Gel in Richtung der Anode und je größer die Sequenz, desto langsamer kann sie sich durch das Gel bewegen. Betrachten wir nach einiger Zeit (20 – 30 min) unser Gel unter UV-Licht ergeben sich zum Beispiel solche Bilder:
Betrachten wir den Ausschnitt genauer: Im oberen Teil des Bildes erkennen wir die Kammern von denen aus die DNA hinunter, das heißt in Richtung Anode, gelaufen ist. Betrachten wir also die verschiedenen Spalten (von links nach rechts): In die erste Kammer habe ich eine so genannte DNA-Ladder gegeben. Sie beinhaltet beliebige Sequenzen zu 100, 200, 300, … 1000 Basenpaaren. Die unterste Bande war die Sequenz mit 100 Bp, die zweite von unten die Sequenz mit 200 Bp und so weiter. Das Interessante kommt aber erst jetzt: Die nächste Spalte ist das erste richtige Ergebnis! Wir haben hier versucht, das für RANK zuständige Gen mittel Cre/loxP zu eliminieren. Jetzt können wir also die Genotypen unterscheiden indem wir zwischen einer wildtyp-, einer gefloxten und einer Δ-Sequenz (vollständig deletiert) differenzieren. Verena erklärt, dass die Wildtypen die kürzesten, die gefloxten Mäuse die mittellangen und die Δ-Tiere die längsten Sequenzen haben. Für unsere Analyse bedeutet es also folgendes: In der ersten Spalte finden wir zwei Banden, eine auf oberer Höhe (circa 600 Bp, siehe DNA-Ladder; entspricht Δ) und eine auf mittlerer Höhe (circa 400 Bp, siehe DNA-Ladder; entspricht floxed). Merke: Das Tier Nr 1 ist also ein Heterozygote und zwar fl/Δ (floxed-Delta). Nr 2 wäre dann ein Homozygot fl/fl (floxed-floxed), Nr 3 wie Nr 1, Nr 4 fl/+ (floxed-plus), Nr 5 Δ/+ (Delta-plus) und so weiter. Das „+“ steht für Wildtyp. Bei Nummer sieben hat anscheinend die PCR nicht funktioniert und die beide letzten Spalten sind Kontrollspalten, von denen wir wissen, dass sie fl/Δ beziehungsweise fl/+ sind. Für alle weiteren Versuche und Züchtungen und Kreuzungen müssen wir den Genotyp natürlich immer genau wissen. Eine Sache ist mir jedoch während Verenas Erklärungen aufgefallen: Wie kann es sein, dass eine Δ-Sequenz größer ist als eine wildtyp? Wie kann es sein, dass eine Sequenz, die nicht mehr da ist (außer den Primern natürlich), größer ist, als eine die eben schon noch da ist? Das ganz funktioniert anscheinend so (Ich habe versucht eine Skizze in PowerPoint zu zeichnen):
Ich habe eine Sequenz, genauer: bestimmte „Exons“, also jene DNA-Sequenzen, die für die Proteine zuständig sind, der „wesentliche Teil“ könnte man auch sagen. Der andere Teil der DNA sind so genannte Introns, aber sie sind noch relativ unerforscht und wurden bis vor kurzem noch für Müll gehalten. Inzwischen nimmt man an, dass sie Regulatoren für bestimmte Prozesse sind. Jedenfalls habe ich zum Beispiel meine für RANK zuständigen Exons (blaue Balken, siehe Skizze). Ich setzte die ersten beiden Primer VOR diese Exons. Das heißt, eigentlich vervielfältigen wir im PCR nicht einmal das Gen selbst sondern nur ein kurzes Stück DNA, von dem wir dann auf den Genotyp rückschließen können. Unsere insgesamt drei Primer (grüne Pfeile) sind also wie auf der Skizze zu sehen gesetzt. Bei einem Wildtyp würde jetzt die vermehrte DNA, genau die Sequenz zwischen forward- und erstem reverse-Primer sein. Der dritte Primer ist NACH den Exons gesetzt und damit viel zu weit weg für die Polymerase. Bei dem gefloxten Tier haben wir eine loxP-Stelle (rot) genau in der Sequenz zwischen den ersten beiden Primern und damit ist die von PCR vervielfältigte Sequenz genau um die Größe einer loxP-Stelle größer. Der dritte Primer kommt erst bei Delta ins Spiel. Hier wurde unser Gen bereits mittels Cre/loxP eliminiert und alles was übriggeblieben ist, ist nur eine loxP-Stelle. Auch die Sequenz, an der normal der zweite Primer binden hätte können, ist weg. Was uns bleibt, ist eine Sequenz zwischen dem ersten und dem dritten Primer, welcher nun auch in Reichweite ist. Dass diese Sequenz die längste ist, ist aber zufällig in unserem Fall so, und nur auf die Primerwahl zurückzuführen. So kann Delta durchaus auch größer als floxed oder wildtype sein.
Gelelektrophorese: Die Gelelektrophorese ist eine Methode um die Größe von DNA-Strängen zu analysieren. Damit können wir zum Beispiel die Genotypen unserer Versuchstiere bestimmen, das heißt, wir untersuchen zum Beispiel, was für Genotypen aus unseren Kreuzungen hervorgegangen sind. Wir stellen uns also ein Agarosegel her indem wir Agarose in einem Puffer aufkochen und Ethidiumbromid als Farbstoff hinzugeben. Ethidiumbromid lagert sich in die DNA ein und mach sie dann unter UV-Licht sichtbar. Das Gel verfestigt sich mit einem „Kamm“ in einer Kammer. Unsere mit PCR vervielfältigte DNA wird noch mit einem weiteren Farbstoff versehen und wird in die durch die Zähne des Kamms entstandenen kleinen Kammern im Gel hinein pipettiert. Das Gel ist jetzt in einer mit Elektroden versehenen Wanne, welche wiederum mit einem Puffer gefüllt wird. Anschließend lege ich eine Gleichspannung von circa 140 Volt an. Weil DNA negativ geladen ist zieht es sie durch das Gel in Richtung der Anode und je größer die Sequenz, desto langsamer kann sie sich durch das Gel bewegen. Betrachten wir nach einiger Zeit (20 – 30 min) unser Gel unter UV-Licht ergeben sich zum Beispiel solche Bilder:
Betrachten wir den Ausschnitt genauer: Im oberen Teil des Bildes erkennen wir die Kammern von denen aus die DNA hinunter, das heißt in Richtung Anode, gelaufen ist. Betrachten wir also die verschiedenen Spalten (von links nach rechts): In die erste Kammer habe ich eine so genannte DNA-Ladder gegeben. Sie beinhaltet beliebige Sequenzen zu 100, 200, 300, … 1000 Basenpaaren. Die unterste Bande war die Sequenz mit 100 Bp, die zweite von unten die Sequenz mit 200 Bp und so weiter. Das Interessante kommt aber erst jetzt: Die nächste Spalte ist das erste richtige Ergebnis! Wir haben hier versucht, das für RANK zuständige Gen mittel Cre/loxP zu eliminieren. Jetzt können wir also die Genotypen unterscheiden indem wir zwischen einer wildtyp-, einer gefloxten und einer Δ-Sequenz (vollständig deletiert) differenzieren. Verena erklärt, dass die Wildtypen die kürzesten, die gefloxten Mäuse die mittellangen und die Δ-Tiere die längsten Sequenzen haben. Für unsere Analyse bedeutet es also folgendes: In der ersten Spalte finden wir zwei Banden, eine auf oberer Höhe (circa 600 Bp, siehe DNA-Ladder; entspricht Δ) und eine auf mittlerer Höhe (circa 400 Bp, siehe DNA-Ladder; entspricht floxed). Merke: Das Tier Nr 1 ist also ein Heterozygote und zwar fl/Δ (floxed-Delta). Nr 2 wäre dann ein Homozygot fl/fl (floxed-floxed), Nr 3 wie Nr 1, Nr 4 fl/+ (floxed-plus), Nr 5 Δ/+ (Delta-plus) und so weiter. Das „+“ steht für Wildtyp. Bei Nummer sieben hat anscheinend die PCR nicht funktioniert und die beide letzten Spalten sind Kontrollspalten, von denen wir wissen, dass sie fl/Δ beziehungsweise fl/+ sind. Für alle weiteren Versuche und Züchtungen und Kreuzungen müssen wir den Genotyp natürlich immer genau wissen. Eine Sache ist mir jedoch während Verenas Erklärungen aufgefallen: Wie kann es sein, dass eine Δ-Sequenz größer ist als eine wildtyp? Wie kann es sein, dass eine Sequenz, die nicht mehr da ist (außer den Primern natürlich), größer ist, als eine die eben schon noch da ist? Das ganz funktioniert anscheinend so (Ich habe versucht eine Skizze in PowerPoint zu zeichnen):
Ich habe eine Sequenz, genauer: bestimmte „Exons“, also jene DNA-Sequenzen, die für die Proteine zuständig sind, der „wesentliche Teil“ könnte man auch sagen. Der andere Teil der DNA sind so genannte Introns, aber sie sind noch relativ unerforscht und wurden bis vor kurzem noch für Müll gehalten. Inzwischen nimmt man an, dass sie Regulatoren für bestimmte Prozesse sind. Jedenfalls habe ich zum Beispiel meine für RANK zuständigen Exons (blaue Balken, siehe Skizze). Ich setzte die ersten beiden Primer VOR diese Exons. Das heißt, eigentlich vervielfältigen wir im PCR nicht einmal das Gen selbst sondern nur ein kurzes Stück DNA, von dem wir dann auf den Genotyp rückschließen können. Unsere insgesamt drei Primer (grüne Pfeile) sind also wie auf der Skizze zu sehen gesetzt. Bei einem Wildtyp würde jetzt die vermehrte DNA, genau die Sequenz zwischen forward- und erstem reverse-Primer sein. Der dritte Primer ist NACH den Exons gesetzt und damit viel zu weit weg für die Polymerase. Bei dem gefloxten Tier haben wir eine loxP-Stelle (rot) genau in der Sequenz zwischen den ersten beiden Primern und damit ist die von PCR vervielfältigte Sequenz genau um die Größe einer loxP-Stelle größer. Der dritte Primer kommt erst bei Delta ins Spiel. Hier wurde unser Gen bereits mittels Cre/loxP eliminiert und alles was übriggeblieben ist, ist nur eine loxP-Stelle. Auch die Sequenz, an der normal der zweite Primer binden hätte können, ist weg. Was uns bleibt, ist eine Sequenz zwischen dem ersten und dem dritten Primer, welcher nun auch in Reichweite ist. Dass diese Sequenz die längste ist, ist aber zufällig in unserem Fall so, und nur auf die Primerwahl zurückzuführen. So kann Delta durchaus auch größer als floxed oder wildtype sein.
