Stammzellen für Knockouts - Homologe Rekombination
23:42 / 16.08.2009
Heute hat mir Verena endlich den Prozess der homologen Rekombination erklärt: Jede Zelle hat natürlich sowohl einen paternalen, als auch einen maternalen DNA-Doppelstrang, also einen Teil der Mutter und einen Teil des Vaters. Die homologe Rekombination passiert normalerweise während der Meiose. Einer der beiden Doppelstränge bricht auf und es kommt zu einem so genannten Crossing-over. Ich habe versucht in PowerPoint eine Skizze dazu zu zeichnen:
Nehmen wir an, der maternale Strang (rot) sei unterbrochen (1). Bestimmte Enzyme (glaube ich – werde ich nochmal nachlesen) kommen jetzt zum Einsatz, die die beiden Stränge noch weiter abbauen, aber in die jeweils entgegengesetzte Richtung (2). Ein weiteres Enzym kommt zum Einsatz und trennt den anderen Doppelstrang (blau) auf. Das gibt einem roten Strangarm die Möglichkeit, sich in die entstandene Schlaufe „einzufädeln“ und dort mit den komplementären Basen zu binden (3). Weil sich die beiden Stränge sehr ähnlich sein müssen, damit sie richtig binden, nennt man es „homologe“ Rekombination. Jetzt kommt wieder unsere Polymerase ins Spiel und ergänzt den fehlenden Strang – aber mit dem jeweils anderen Strang, da ja auch dort die Strangarme gebunden haben (4). Wenn alles Fehlende ergänzt wurde, hat nun ein weiteres Enzym, die Fähigkeit, DNA an bestimmten Stellen zu schneiden. Und genau das tut es dann auch (5). Jetzt haben wir wieder zwei vollständige Stränge, jedoch mit einigen Austäuschen (6). Es gibt auch noch andere Stellen, an denen die Stränge wieder zerschnitten werden können um so andere Kombinationen am Ende zu erhalten. Diese Prinzipien nützt man auch aus, um zum Beispiel embryonale Stammzellen zu verändern (Für Knockout-Mäuse, et cetera). Das heißt man schleust eine Sequenz mittels Elektroporation (Zellmembran wird kurzzeitig permeabel) in eine Zelle und diese legt sich dann an die bestehende DNA an und es kommt zur homologen Rekombination. In der Regel wird eines der jeweiligen Exons deaktiviert (überschrieben etc.) um ein Gen inaktiv zu machen, also um es auszuknocken. Weil homologe Rekombination keineswegs immer stattfindet, nachdem man die fremde Sequenz eingeschleust hat, sondern auch zum Beispiel die zufällige Integration (die Sequenz integriert sich an zufälliger Stelle) stattfinden könnte, beinhaltet ebendiese Sequenz auch positiv- oder negativ-Marker. Zum Beispiel werden Zellen gegen Antibiotika resistent, wenn die Sequenz an der richtigen Stelle eingebaut wurde, oder sie zerstören sich selbst durch Toxine, wenn sie an der falschen Stelle eingebaut wurden. Da ich nächste Woche mit Arabella arbeiten werde und sie sich mit solchen Dingen beschäftigt (glaube ich) werde ich dann sicher mehr dazu sagen können.
Nehmen wir an, der maternale Strang (rot) sei unterbrochen (1). Bestimmte Enzyme (glaube ich – werde ich nochmal nachlesen) kommen jetzt zum Einsatz, die die beiden Stränge noch weiter abbauen, aber in die jeweils entgegengesetzte Richtung (2). Ein weiteres Enzym kommt zum Einsatz und trennt den anderen Doppelstrang (blau) auf. Das gibt einem roten Strangarm die Möglichkeit, sich in die entstandene Schlaufe „einzufädeln“ und dort mit den komplementären Basen zu binden (3). Weil sich die beiden Stränge sehr ähnlich sein müssen, damit sie richtig binden, nennt man es „homologe“ Rekombination. Jetzt kommt wieder unsere Polymerase ins Spiel und ergänzt den fehlenden Strang – aber mit dem jeweils anderen Strang, da ja auch dort die Strangarme gebunden haben (4). Wenn alles Fehlende ergänzt wurde, hat nun ein weiteres Enzym, die Fähigkeit, DNA an bestimmten Stellen zu schneiden. Und genau das tut es dann auch (5). Jetzt haben wir wieder zwei vollständige Stränge, jedoch mit einigen Austäuschen (6). Es gibt auch noch andere Stellen, an denen die Stränge wieder zerschnitten werden können um so andere Kombinationen am Ende zu erhalten. Diese Prinzipien nützt man auch aus, um zum Beispiel embryonale Stammzellen zu verändern (Für Knockout-Mäuse, et cetera). Das heißt man schleust eine Sequenz mittels Elektroporation (Zellmembran wird kurzzeitig permeabel) in eine Zelle und diese legt sich dann an die bestehende DNA an und es kommt zur homologen Rekombination. In der Regel wird eines der jeweiligen Exons deaktiviert (überschrieben etc.) um ein Gen inaktiv zu machen, also um es auszuknocken. Weil homologe Rekombination keineswegs immer stattfindet, nachdem man die fremde Sequenz eingeschleust hat, sondern auch zum Beispiel die zufällige Integration (die Sequenz integriert sich an zufälliger Stelle) stattfinden könnte, beinhaltet ebendiese Sequenz auch positiv- oder negativ-Marker. Zum Beispiel werden Zellen gegen Antibiotika resistent, wenn die Sequenz an der richtigen Stelle eingebaut wurde, oder sie zerstören sich selbst durch Toxine, wenn sie an der falschen Stelle eingebaut wurden. Da ich nächste Woche mit Arabella arbeiten werde und sie sich mit solchen Dingen beschäftigt (glaube ich) werde ich dann sicher mehr dazu sagen können.
