Gestern war der letzte Tag im Labor. Ich hätte nie gedacht, dass vier Wochen so schnell vergehen können. Wir haben noch die ganzen Ergebnisse, die wir in den Western Blots und den FACS erhalten haben, in Grafiken verwandelt, damit wir diese im Bericht veranschaulichen können.
Einerseits bin ich froh, dass die Arbeit vorbei ist, und nun die wirklichen Ferien beginnen, aber auf der anderen Seite hat es mir im Labor sehr gut gefallen. Um ehrlich zu sein, würde ich lieber ein Jahr im Labor arbeiten, als in die Schule zu gehen *gg*.

Heute haben wir auf die Membran, die wir gestern gemacht haben, den zweiten Antikörper gegeben. Dann haben wir unsere Zellen 1:7 gesplittet und den Rest in vier Petrischalen und in eine 6-well-Platte aufgeteilt. Aus den Petrischalenzellen werden wir wieder einen Western Blot machen und die Zellen aus den Wells werden wir facsen.
Danach haben wir die Zellen aus der 6-well-Platte, in die wir am Mittwoch das AMF in verschiedenen Konzentrationen gegeben haben, geerntet und für das FACS vorbereitet. Dazu muss man die Zellen mit Überstand in ein sogenanntes FACS-Röhrchen füllen, dann zentrifugieren, den neuen Überstand abkippen, mit Binding Buffer und Annexin V resuspendieren und 20 Minuten lichtgeschützt stehen lassen. Dann wird noch ein Mal zentrifugiert und abschließend das Pellet mit Binding Buffer resuspendiert. Kurz bevor man facst, gibt man noch Probidiumiodid hinzu. Am Computer kann man dann die Anzahl der Zellen, die man facsen will, einstellen und der Computer misst dann an genau dieser Menge Zellen ihre Granulität, Größe und ob Annexin V und/oder das Probidiumiodid ein Signal gibt.
Annexin V und Probidiumiodid sind zwei Marker, mit denen man feststellen kann, wie stark die Apoptose schon fortgeschritten ist.

Heute haben Tobias und ich mit Proben von unserem Betreuer einen Western Blot gemacht und die PCR gemacht. Dabei ist herausgekommen, dass beide Mastermixe gleich gut arbeiten. Am Nachmittag haben wir wieder Zellen von einer anderen Arbeiterin gefacst.

Heute haben wir zuerst AMF aufie Zellen in der 6-Well-Platte gegeben. In die Wells kamen 0, 1, 10 und 15 µl. Dann wollten wir eigentlich die Schnitte, die wir gestern gefärbt haben, unter dem Mikroskop anschauen, aber dann stellte sich heraus, dass die Quecksilberdampflampe kaputt ist. Deswegen mussten wir umdisponieren und gingen stattdessen zu einem Mikrotom und Tobias und ich durften selbst schneiden. Normalerweise sind die Schnitte ca. 3 µm dick, doch um es für uns einfacher zu machen, schnitten wir sie 7 µm dick. Unsere Schnitte werden wir später noch färben.
Dann haben wir noch in der RNAse-freien Lamina die Proben für die PCR, die wir morgen machen werden, vorbereitet. Dabei werden wir zwei verschiedene Mastermixe gegeneinander austesten.

Heute habe ich erfahren, dass der Power Supply, mit dem die geordneten Proteine auf die Membran übertragen wurde, kaputt war und alles gekocht wurde. Die Membran ist also nicht mehr zu gebrauchen.
Wir haben dann einfach die Zellen aus der Flasche 1:5 gesplittet und den Rest so auf eine 6-Well-Platte aufgeteilt, dass jeweils 80 000 Zellen in 3ml Medium pro Well sind. Morgen werde ich dann AMF in verschiedenen Konzentrationen dazugeben (0, 1, 10 und 15 µl).
Am Nachmittag haben wir und mein Betreuer eine HE-Färbung an verschiedenen Schnitten gemacht. Dazu werden die Objektträger zuerst in Hämatoxylin getaucht (4 min), dann wird die Farbe, die die Zellkerne färbt, mit Leitungswasser blau gefärbt und zum Abschluss werden sie noch 30 sek. in Eosin gefärbt, um auch das Plasma rot zu färben.

Heute haben wir mit den Zellen, die wir am Montag eingefroren haben, weitergemacht. Ich habe einfach die normale Reihenfolge des Western Blots, die ich schon beschrieben habe, eingehalten.
Während das Ergebnis vom Gel auf die Membran übertragen wurde, habe ich noch schnell einen Mediumwechsel bei den Zellen aus der Flasche gemacht.

Heute haben wir zum dritten Mal den sekundären Antikörper aufgetragen. Diesmal will ich die Capsase 3 markieren. Nachdem wir die Membranen inkubieren lassen haben, haben wir sie wieder gescannt und ausgewertet. Dann haben wir sie wieder gestrippt und zurück in den Kühlraum gelegt.
Dann habe ich bei den Zellen, die noch in der Flasche waren, einen Mediumwechsel gemacht und begonnen, die Zellen aus den Petriflaschen für die Weiterarbeit vorzubereiten. Dazu habe ich wieder das Medium in ein Zentrifugenröhrchen gefüllt, mit PBS gewaschen, die anhaftenden Zellen mit Trypsin gelöst und alles zentrifugiert. Das Zellpellet haben wir dann mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und dann tiefgefroren, um am Montag mit ihnen weiterzuarbeiten.

Heute haben wir die zweiten Antikörper abgewaschen. Somit konnten wir die Mebranen einscannen und auswerten. Danach haben wir die Membranen gestrippt und wiederum mit neuen Antikörpern (bax und bcl-2) benetzt.
Die Zellen, die wir noch in der Flasche gelassen haben, haben wir im Verhältnis 1:10 gesplittet und den Rest auf vier Petrischalen aufgeteilt. Die Flaschen und Schalen kamen wieder in den Inkubator mit 37°.
Am Nachmittag haben Tobias und ich meinem Betreur bei einer Mikrodissektion zugeschaut. Dabei schaut man durch ein spezielles Mikroskop auf einen Objektträger mit einer Gewebsprobe von einem Krebsgewebe. Wenn man Krebszellen lokalieiert hat, kommt eine Laser zum Einsatz. Mit ihm wird eine Membran, die auf einem Cap angebracht knapp über dem Objektträger liegt, geschossen und diese so zum Schmelzen gebracht. Die Membran schmilzt dann auf die angezielten Zellen und bleibt an ihnen haften. Wenn man das Cap wieder aus dem Mikroskop nimmt, hat man reine Karzinomzellen auf der Membran und kann diese weiter untersuchen.
Später sind wir wieder mit Tobias' Betreuer zum FACS gegangen und haben Zellen von einer anderen Laborantin gefacst.