Heute begann ich mit Gel-Gießen (präparatives Gel) und dem anschließenden Vorbereiten für die Elektrophorese meiner über Nacht verdauten Plasmide. Nachdem Marker und loading dye auch vorbereitet wurden, ließ ich die Elektrophorese laufen. Das Ergebnis war genauso wie erhofft und entsprechend schön. Nachdem ich die DNA, des Slots (mit dem Plasmid, welches sowohl mit HindIII als auch mit Spe I verdaut wurde) herausgeschnitten hatte, wusch ich das Gel-Stückchen. Allerdings betrug meine daraus gewonnene DNA allein, so sagte mir das Fotometer, 4ng/ul. Eine Menge mit der man eigentlich gar nichts anfangen kann....was wirklich passiert ist weiß ich nicht. Auf jeden Fall haben wir einen neuen Verdau angesetzt und werden das ganzen nochmals wiederholen. Währendessen hat Julia die transformierten Bakterien mit dem speziellen Kit gewaschen, DNA gemessen, nochmals gefällt und auch das zum Verdau angesetzt.. Mit diesem Plasmid (psiCHECK2) wird morgen dasselbe passieren, d.h. Elektrophorese, waschen usw.

Aufgabe dieser Woche ist es, ein von uns modifiziertes Konstrukt, d.h. bestehend aus Insert (in unserem Fall 3'UTR-Region mit Bindungsstelle für miRNA) und Vektor mit Luciferase, Promoter und Ampicillin -Gen, herzustellen bzw. es zu klonieren. Nachdem wir über Nacht unsere Primer (genauer: schon vorher mit dem Plasmid pMIR-reporter transformierte Bakterien-Kolonie) in Nährmedium bei 37°C inkubiert hatten, konnten wir heute den enormen Bakterienzuwachs mit einem speziellen Kit waschen und anschließend messen. Da die Konzentration der dsDNA nicht ausreichend genug war, erstellten wir eine höhere Konzentration, die mit 950 ng/ul ein zufriedenstellendes Ergebnis zeigte (auch da Verunreinigungen sich nicht in erhöhtem Ausmaß zeigten). Diese DNA-Konzentration ließen wir dann mit unseren Restriktionsenzymen HindIII und SpeI verdauen. (einmal nur mit HindIII, einmal nur mit SpeI, einmal doppelt geschnitten, einmal ungeschnitten)Unsere Absicht: das Plasmid so zu zerstückeln, dass ein Stück von ca. 60bp herausgeschnitten wird und zwar mit den Enzymen, die die sticky ends des Inserts darstellen. Wie der Verdau über Nacht funktioniert hat, werden wir morgen mittels Elektrophorese überprüfen.

Der heutige Tag begann mit einem Ausflug - einem farbigen Ausflug. Im Konvokalmikroskop schauten wir uns humane Stammzellen, die zu Fettzellen differenzieren, an. Die DNA wurde am Tag zuvor mit dem Farbstoff DAPI, der sich in der großen Furche der DNA, d.h. zwischen den Histonen anlagert, gefärbt. So erschien der Zellkern unter UV-Licht blau, das Protein ß-Catenin, das normalerweise im Cytoplasma abgebaut wird aufgrund einer spezifischen Bindung zweier Antikörper mit UV-Licht emittierenden Nanopartikel auf sekundären Antikörper rot. Ziel sollte sein, dass das ß-Catenin um den Zellkern akkumuliert ode besser in den Zellkern wandert- geklappt hat es nur teils. Es war echt spannend dreidimensionale Bilder auf Lehrbuchniveau zu kreieren. Anschließend gings über zum Labmeeting, danach pflegten wir noch unsere Hela-Zellen - Passage 29. Es war ein 1:2 Passagieren. Die Zellen werden zunächst zweimal mit PSB gewaschen, anschließend mit Trypsin vom Boden, aufgrund ihrer adhärenten Eigenschaft, gelöst und anschließend für eine Minute inkubiert. Daraufhin wurde genauso viel altes Medium (natürlich mit den Zellen) wie neues in ein neues Fläschchen gegeben.

Gestern konnten wir einen Teil eines am Institut laufenden Versuchs mitverfolgen: Aus transgenen Mäusen (mit fluoriszierenden YFP- gelb fluoriszierendes Protein) wurde Milz, Leber und Blut entnommen. Daraus, aus Milz und Leber wurden mittels Kleinschneiden bzw. Verabreichung von Collagenase die Zellen aus dem Gewebebestand herausgelöst und Schritt für Schritt unter Zugabe von Buffer (PBS) und Serum verdünnt. Zwischen den einzelnen Verdünnungsschritten wurde zudem für einige Minuten zentrifugiert, rote Blutzellen lysiert, bis am Ende nur mehr unsere gewünschten Zellen, hoffentlich aus Mäusen, die die Fähigkeit zur Fluoreszenz haben, übrig blieben. Dies wurde nach Zellzählung entgültig verdünnt (1/10 Verdünnung). Darauf wurden ein primärer und ein sekundärer Antikörper gegeben. Der erste hat die Fähigkeit an jeder Endothelzelle -grundsätzlich bei allen Säugetieren- zu binden, der sekundäre bindet am primären Antikörper. Aufgrund der Bindung emittiert das Florochrom, Bestandteil des Antikörpers, unter Laser-Licht spezifisch. Unter dem Facs-Gerät sollte die Endothelzelle der transgenen Maus demnach zweimal leuchten (unterschiedliche Wellenlängen): einmal aufgrund YFP, einmal aufgrund der Antkörper, die an der Oberfläche der Endothelzellen festsitzen. Die Endothelzellen der Kontrollmäuse (ohne YFP) sollten nur einmal leuchten. Aber genau dies war nicht der Fall, leider lag das Problem an den transgenen Mäusen, scheinbar fehlte das YFP...Na gut, auch das kommt vor...
Heute beschäftigten wir uns mit dem Western-Blot, d.h. schauten beim Trenngel und Sammelgel -Gießen zu, bei der Trennung nach Größe des Proteins und anschließend bei der Vorbereitung der Membran bzw. des eigentlichen Western-Blots. Kurz um, Western-Blot funktioniert ähnlich einer Gel-Elektrophorese, nur dass es für Proteine und nicht für Nucleinsäuren verwendet wird. Die Proteine werden ihrer Größe nach aufgetrennt und haften an Membran, von dort aus werden sie mittels zwei Antikörper detektiert. Anschließend hatten wir noch eine kleine Einführung ins Zellen-Passagieren bzw. Mediumherstellen- gearbeitet wurde mit HELA-Zellen.

Und los gings in die neue Woche...als erstes schauten wir Lisa bei der RNA-Isolierung bzw. -Waschung zu: TRizol zum Aufbrechen der Zellen, Chloroform für die Phasentrennung - RNA schwimmt oben, DNA im organischen Teil unten, dazwischen milchige Phase bestehend aus Proteinen- RNA-Phase wird abgehoben, und über Isopropanol bleibt RNA-Pellet zurück, mit Ethanol (70%) gewaschen, trocknen lassen und anschließend wieder mit RNase freiem Wasser befeuchten; anschließend wurden die gewonnen Proben mit dem Photometer nach Massenanteil gemessen. Übrigens entstammte die mRNA aus Zellen osteogener Differenzierung - Ziel ist, die unterschiedliche Expression für die osteogene Differenzierung nach vorheriger unterschiedlicher "Stimulierung" (über microRNA) von Genen wie das BMP2 zu untersuchen. Dazu muss die mRNA in cDNA mittels Reverser Transkriptase, dT-Primer (hängt sich an komplimentären Poly-A-Schwanz an) umgeschrieben werden. Danach wird eine Real-time-PCR durchgeführt: einmal mit den veränderten Proben, einmal aus den selben Zellen gewonnenen Housekeeping-Genen (Referenz-Gene, die in Zellen immer expremiert werden, da für notwendige Stoffwechselprozesse beispielsweise n zuständig). Der Mengenanteil der expremierten Bestandteile, wird im Verhältnis zur Standardkurve des BMP2 ermittelt, die Expression in der Kontrolle (Housekeeping-Gene) sollte überall gleich bleiben. Anschließend haben wir noch kurz die Mäuse versorgt, aus denen wir morgen Endothelzellen aus Milz und Leber für einen weiteren Versuch gewinnen werden. Dann schauten wir noch Matthias bei der Herstellung einer microRNA in cDNA - Umschreibereaktion zu - gelooptes Konstrukt mit Basenverlängerung wird hergestellt. Dazu übten wir das ganz praktische reverse Pipettieren.