Und los gings in die neue Woche...als erstes schauten wir Lisa bei der RNA-Isolierung bzw. -Waschung zu: TRizol zum Aufbrechen der Zellen, Chloroform für die Phasentrennung - RNA schwimmt oben, DNA im organischen Teil unten, dazwischen milchige Phase bestehend aus Proteinen- RNA-Phase wird abgehoben, und über Isopropanol bleibt RNA-Pellet zurück, mit Ethanol (70%) gewaschen, trocknen lassen und anschließend wieder mit RNase freiem Wasser befeuchten; anschließend wurden die gewonnen Proben mit dem Photometer nach Massenanteil gemessen. Übrigens entstammte die mRNA aus Zellen osteogener Differenzierung - Ziel ist, die unterschiedliche Expression für die osteogene Differenzierung nach vorheriger unterschiedlicher "Stimulierung" (über microRNA) von Genen wie das BMP2 zu untersuchen. Dazu muss die mRNA in cDNA mittels Reverser Transkriptase, dT-Primer (hängt sich an komplimentären Poly-A-Schwanz an) umgeschrieben werden. Danach wird eine Real-time-PCR durchgeführt: einmal mit den veränderten Proben, einmal aus den selben Zellen gewonnenen Housekeeping-Genen (Referenz-Gene, die in Zellen immer expremiert werden, da für notwendige Stoffwechselprozesse beispielsweise n zuständig). Der Mengenanteil der expremierten Bestandteile, wird im Verhältnis zur Standardkurve des BMP2 ermittelt, die Expression in der Kontrolle (Housekeeping-Gene) sollte überall gleich bleiben. Anschließend haben wir noch kurz die Mäuse versorgt, aus denen wir morgen Endothelzellen aus Milz und Leber für einen weiteren Versuch gewinnen werden. Dann schauten wir noch Matthias bei der Herstellung einer microRNA in cDNA - Umschreibereaktion zu - gelooptes Konstrukt mit Basenverlängerung wird hergestellt. Dazu übten wir das ganz praktische reverse Pipettieren.