Gestern konnten wir einen Teil eines am Institut laufenden Versuchs mitverfolgen: Aus transgenen Mäusen (mit fluoriszierenden YFP- gelb fluoriszierendes Protein) wurde Milz, Leber und Blut entnommen. Daraus, aus Milz und Leber wurden mittels Kleinschneiden bzw. Verabreichung von Collagenase die Zellen aus dem Gewebebestand herausgelöst und Schritt für Schritt unter Zugabe von Buffer (PBS) und Serum verdünnt. Zwischen den einzelnen Verdünnungsschritten wurde zudem für einige Minuten zentrifugiert, rote Blutzellen lysiert, bis am Ende nur mehr unsere gewünschten Zellen, hoffentlich aus Mäusen, die die Fähigkeit zur Fluoreszenz haben, übrig blieben. Dies wurde nach Zellzählung entgültig verdünnt (1/10 Verdünnung). Darauf wurden ein primärer und ein sekundärer Antikörper gegeben. Der erste hat die Fähigkeit an jeder Endothelzelle -grundsätzlich bei allen Säugetieren- zu binden, der sekundäre bindet am primären Antikörper. Aufgrund der Bindung emittiert das Florochrom, Bestandteil des Antikörpers, unter Laser-Licht spezifisch. Unter dem Facs-Gerät sollte die Endothelzelle der transgenen Maus demnach zweimal leuchten (unterschiedliche Wellenlängen): einmal aufgrund YFP, einmal aufgrund der Antkörper, die an der Oberfläche der Endothelzellen festsitzen. Die Endothelzellen der Kontrollmäuse (ohne YFP) sollten nur einmal leuchten. Aber genau dies war nicht der Fall, leider lag das Problem an den transgenen Mäusen, scheinbar fehlte das YFP...Na gut, auch das kommt vor...
Heute beschäftigten wir uns mit dem Western-Blot, d.h. schauten beim Trenngel und Sammelgel -Gießen zu, bei der Trennung nach Größe des Proteins und anschließend bei der Vorbereitung der Membran bzw. des eigentlichen Western-Blots. Kurz um, Western-Blot funktioniert ähnlich einer Gel-Elektrophorese, nur dass es für Proteine und nicht für Nucleinsäuren verwendet wird. Die Proteine werden ihrer Größe nach aufgetrennt und haften an Membran, von dort aus werden sie mittels zwei Antikörper detektiert. Anschließend hatten wir noch eine kleine Einführung ins Zellen-Passagieren bzw. Mediumherstellen- gearbeitet wurde mit HELA-Zellen.