mit den rattenhirnen..

1.) gewebe in kleine stücke schneiden (mit skalpell)
2.) gewebe in falconröhrchen geben (pasteurpipette)- 1min bei 250g zentrifugieren
3.) überstand abpipettiern und 1ml enzymmix dazugeben
4.) rörhcen ins wasserbad stellen: 40min (Gewebe von einem tier bis zu einer woche) oder 90 minuten (1 woche bis 2 monate altes tier)- alle 20 minuten soll das gewebe vorsichtig mit einer pasteurpipette auf und ab pipettiert werden (gewebe dabei licht zermahlen)
5.) 5 minuten bei 250g zentrifugieren und überstand absaugen
6.) 4ml trypsininhibitor dazugeben
7.) 10mal mit pasteupipette auf und ab pipettieren ACHTUNG: luftblasenfrei
8.) röhrchen für 10minuten ins wasserbad geben
9.) 5minuten bei 500g zentrifugieren und den überstand absaugen
10.) Zellen in 500µl SFM resuspendieren und auf und ab pipettieren

100ml SFM (serum free media):

94.3ml DMEM/F12
1ml Glucoselösung
0.5 ml IM Hepes Buffer
0.1ml Progesterone (1000x)
50µl Putrescine (100x)
7.32µl Heparin (0.05 g in 2ml lösen)
--> alles filtieren
2ml B27 Growth Supplement
20µl EGF-Stock
20µl FGF
100µl ITSS *

*Insulin 1:200
Transferin 1:10
Sodium 1:1000
die drei zutaten 1:1:1 mischen