mit den rattenhirnen..

1.) gewebe in kleine stücke schneiden (mit skalpell)
2.) gewebe in falconröhrchen geben (pasteurpipette)- 1min bei 250g zentrifugieren
3.) überstand abpipettiern und 1ml enzymmix dazugeben
4.) rörhcen ins wasserbad stellen: 40min (Gewebe von einem tier bis zu einer woche) oder 90 minuten (1 woche bis 2 monate altes tier)- alle 20 minuten soll das gewebe vorsichtig mit einer pasteurpipette auf und ab pipettiert werden (gewebe dabei licht zermahlen)
5.) 5 minuten bei 250g zentrifugieren und überstand absaugen
6.) 4ml trypsininhibitor dazugeben
7.) 10mal mit pasteupipette auf und ab pipettieren ACHTUNG: luftblasenfrei
8.) röhrchen für 10minuten ins wasserbad geben
9.) 5minuten bei 500g zentrifugieren und den überstand absaugen
10.) Zellen in 500µl SFM resuspendieren und auf und ab pipettieren

100ml SFM (serum free media):

94.3ml DMEM/F12
1ml Glucoselösung
0.5 ml IM Hepes Buffer
0.1ml Progesterone (1000x)
50µl Putrescine (100x)
7.32µl Heparin (0.05 g in 2ml lösen)
--> alles filtieren
2ml B27 Growth Supplement
20µl EGF-Stock
20µl FGF
100µl ITSS *

*Insulin 1:200
Transferin 1:10
Sodium 1:1000
die drei zutaten 1:1:1 mischen

material:
ripa-buffer:
tris HCL 50mM
nacl 150mM
edta 5mM
SDS 0,1%
Natriumdeoxycholat 1%
triton x-100
pmsf 1mM

fsb:
TrisHCL pH6,8
SDS
beta- Meracaptoethanol
Glycerin
Promphenolblau

CAPS Transfer Buffer:
2,2 g CAPS pH11 (1M NaOH)
+100ml MeOH

TBS pH7,6:
20mM TRIS
137 mM NaCl
pH mit rauchender HCL auf 7,6

TTBS:
100ml 10*TBS+ 900ml H2O
1ml Tween 20

running buffer:
60g tris
288g glycin
20g sds

gele:

trenngel:
ddH2O
Acrylamidstock 30%
trenngel stock pH8,8
APS
Temed

sammelgel:
ddH2O
Acrylamidstock 30%
trenngel stock pH6,8
APS
Temed
Bromphenolblau

1.) zellen ernten:

- zellen in der petrischale 3x mit PBS waschen (10ml)
- 1ml RIPA-buffer (bewirkt lysierung)
-scratchen

2.) probenmessung:

- probe mit bradford reagenz (1:5 verdünnen) mischen
- 5min inkubieren
- bei einer konzentration von 15µg/ml aufs gel auftragen

3.) gel gießen/ sds-page-elektrophorese:

- gel zwischen glasplatten gießen und in u-ständer einhängen
- zuerst trenn-(acrylamid polymerisiert und in diesem netz "wandern" die proteine") dann sammelgel (komprimiert proben)
- laufpuffer hineingießen (wirkt denaturierend und stabilisiert pH-wert)
- spannung anschließen (200V für 10min, 1 1/2 h bei 100V)
- die proteine wandern nun je nach gewicht zu dem anderen pol (mit hilfe eines standards, der bekannte größen anzeigt, kann dann die größe des proteins ermittelt werden)

4.) transfer auf pvdf-membran

- zuerst wird die membran in mehtanol getränkt, um sie zu aktivieren (proteine setzen sich dann am kunststoff ab)
- gel auf membran legen
- um das herum ein löschblatt und um das löschblatt einen schwamm
- einklemmen und spannung anlegen
- (proteine werden von sds umhüllt und sind so negativ geladen)
- freie stellen auf der membran werden mit trockenmilchpulver geblockt
- mit puffer spülen (enthält tween 20, welches unspezifische bindungen löst


- mit primärem antikörper inkubieren (wird aus einer ziege gewonnen, in dem ihr das protein verabreicht wird)
- mit sekundärem antikörper inkubieren (wird aus einem esel gewonnen, dem man das blut der ziege gespritzt hat)
- an diesem sekundärem antikörper bindet das hsf-molekül (horseradishperoxidase)
- mit substrat benetzen und inkubieren

--> die peroxidase wandelt den in dem substrat enthaltenen wasserstoffperoxid um und setzt dabei licht frei, das mit hilfe von photofilmen festgehalten werden kann
--> weiters bleibt das substrat auf der peroxidase hängen, was ein markieren des antikörpers ermöglicht

heute haben wir unseren aufgereinigten liquor durch eine aperatur laufen lassen, welche mit hilfe von magnetismus ncam-vesikel "herausfiltert", die zur zeit an neuronen vermutet werden

1.) vesikel in 800µl PBS (phosphate buffered saline) aufnehmen
2.) 10µl breads hinzufügen
3.) 15 min auf eis inkubieren
4.) gefäß equilibrieren (800µl puffer in säule geben, um filter zu benetzen)
5.) probe einfüllen und filtieren lassen
6.) 4x mit 500µl Puffer waschen
7.) noch einmal den gleichen 50µl puffer hinzufügen (in diesem fall harnstoff) und eluieren (magnet entfernen, mit dem stempel das filtrat herausdrücken)
8.) das ganze wiederholen

da wir gerade an einer studie arbeiten, die sich mit liquor befasst, muss dieser natürlich auch aufbereitet werden:

- zellen abzentrifugieren bei 5000rpm für 5min bei 4°C in einer 15ml falcon tube
- liquor in 2ml-röhrchen pipettieren
- nochmals bei 13000rpm für 20min bei 4°C zentrifugieren
- überstand mit der spritze absaugen, nadel verwerfen und spritze auf filter aufsetzen
- in 2ml röhrchen pipettieren á 800 µl
- proteaseinhibitor hinzfügen (1µl/ml)
- röhrchen in den kühlschrank stellen, wenn die probe für das eletkronenmikroskop gedacht ist

zellen können bei -196°C eingeforen und später wieder aufgetaut werden, ohne dabei ihre vitalität zu verlieren. dies liegt an der tatsache, dass ab -120°C keinerlei biochemischen prozesse mehr vorliegen.
beim auftaugen geht man wie folgt vor:

- röhrchen im wasserbad auf 37°C erwärmen und anschließend mit alkohol desinfizieren
- mit warmem medium mischen (ca. 8-10 ml) - in eine 15ml falcon tube füllen
- 3min bei 200g zentrifugieren
- überflüssiges medium absaugen (wichtig, um dmso zu entfernen, da es die zelle im aufgetauten zustand "vergiften" würde)
- zell-pellet mit neuem medium mischen und in eine neue kulturflasche füllen

pcr- ansatz:

367,5 πl h2o
525 πl MM (mastermix= puffer)
525 πl Primermix
DNA-proben

--> mischen und mit öl beschichten (verhindert das verdampfen beim erhitzen)

pcr an sich:

1.) denaturierung:

- mix wird auf 95°C erhitzt, dabei denaturiert das eiweiß und die doppelhelix löst sich in zwei einzelstränge

2.) hybridisierung:

- der mix wird nun auf 55°C abgekühlt. dabei verbindet sich der primer (kurzes stück dna mit definierter sequenz, das als erlängerungspunkt für ploymerasen [ enzyme, die aus nukleotiden dna oder rna ketten knüpfen] dient) mit der dna
- die primer müssen komplementär zum gewünschten sequenzabschnitt sein, um eine stabile bindung zu gewährleisten
- um die bindung noch weiter zu stabilisieren, beginnen nun die polymerasen weitere komplimentärbasen zu verknüpfen und schaffen damit einen völlig identen komplimentärstrang

3.) verlängerung:

- die temperatur wird wieder auf 72°C erhöht (die ideale temperatur für polymerasen)
- die polymerasen fügen weiterhin nukleotide hinzu
- die losen verbindungen (nicht komplementär) brechen wieder auf

--> nach diesen 3 schritten erdoppelt sich die anzahl der dna-moleküle


- abschließend werden die gewünschten abschnitte mit hilfe von schneideenzymen "herausgeschnitten", denn es wäre zu aufwendig die ganze dna zu untersuchen

- arbeitsbank säubern und hände desinfizieren
- medium im wasserbad auf 37°C erwärmen (beim herausnehmen abtrocknen und mit alkohol abwischen)
- altes medium mit hilfe von vakuumpumpe und pasteurpipette absaugen (dabei zellkultur nicht mit pipettenspitze beschädigen)
- zwischen den flasks sollte der aufsatz gewechselt werden
- 10ml des erwärmten mediums in die flask füllen und zellkultur gut benetzen

--> der mediumwechsel ist notwendig, da Zellen metabolisiert werden und bei 37°C mit der zeit zerfallen

--> die wechsel-intervalle variieren aufgrund von metabolismus und wachstumsgeschwindigkeit

--> bei schnell wachsenden zellen empfielt sich ein rhythmus mo-mi-fr-mo
--> bei schlecht wachsenden zellen reicht ein mo-do-mo rhythmus aus (das medium sollte hier nur zur hälfte abgezogen werden, auch wenn es keinen pH umschlag gibt)


nachtrag:

- bei schwimmenden zellen, muss das medium samt zellen in eine tube pipettiert werden
- anschließend muss man warten, bis sie die zellen absetzen
- das medium absaugen, vorsicht! nicht zellen mitabsaugen!
- neues medium in die tube pipettieren und das ganze in die gewünschte kulturflasche oder wells pipettieren

für dna und rna nennt sich die prozedur nothernplotting (für proteine nennt man es westernplotting)

materalien:
- dna proben
- dna leiter (standard) -->zeit bekannte längen an
- tbe-puffer (tris, borat, edta)
- agarose (polysacharid)
- ethidiumbromid
- farbmarker (bromphenolblau)
- elektrophoresekammer
- kamm
- gleichstromquelle

anwendung:
1.) zuerst agarose in tbe-puffer lösen und 3-4 erwärmen, dass sich agarose vollständig löst
2.)ethidiumbromid hinzufügen, gut vermischen
3.)das ganze in gelkammer gießen
4.)kamm reinstecken
5.)1h trocknen lassen, nach trocknen entfernen
6.)entstandene taschen mit puffer spülen
7.)gel in tbe-laufpuffer legen (puffer sollte zirkulieren)
8.)farbmarker zu dna-proben geben und diese in die taschen füllen
9.)gleichstrom 30 min bei 200V anstecken
10.) dna unter uv-licht betrachten (ethidiumbromid fluoresziert bei uv-licht)
11.)anhand der dna-leiter kann man die einzelnen gene genau ablesen

--> vorerst benötigte ingredientien in wasserbad auf 37°C erwärmen

ingredientien für dmem 10% (bezieht sich auf fcs)

500 ml Dulbeccos mit stab. Glutamin
55ml FCS
5,5 ml NEA (nicht essentielle aminosäuren)
5,5ml Gentamycin
175g Glucose
5ml Pyrovat (Aminosäure)

--> alle zutaten zusammenmischen und filtrieren (um eventuelle keime zu vermeiden), anschließend gefäß beschriften und kühl stellen

--> zuerst werden die Zellen von der zellwand gelöst und schwimmen so vereinzelt im medium (siehe splitten)
--> eine Zellprobe entnehmen, und 1:1 mit trypanblau verdünnen (das trypanblau dringt in tote zellen ein und färbt diese dadurch blau)
--> auf die Neubauerkammer auftragen
--> auf dieser kammer ist ein raster-muster vorgegeben, in ca. 16 kästchen die vorhandenen (lebenden!) zellen zählen und *2 rechnen (da die probe ja 1:1 mit trypanblau verdünnt wurde)
--> abschließend rechnet man das ergebnis noch *1000, um die zellanzahl pro milliliter zu berechnen

einfrieren:

--> die zellen zentrifugieren (5minuten bei 150 g), um zellen zu verdichten
--> medium absaugen, sodass zell-pallet übrigbleibt
--> die zellen 1:1 mit gefriermedium mischen
--> dieses medium besteht aus dmso (dimethylsulfoxid-> ist ein gefrierschutz und toxisch), fcs (fötales kälberserum), und normalem medium
--> gefäß beschriften und in mr. frosty zum einfrieren geben