slime..you are disgusting...i love u...xD
23:13 / 26.07.2010
Heute starteten wir frisch und munter (ja..ok..nicht ganz munter..=D) in die neue Woche, welche auch die leider die letzte Arbeitswoche für uns darstellt. Jedenfalls arbeiteten wir heute mit den isolierten RNA Proben von Freitag weiter und führten mit ihnen eine cDNA Synthese durch.
Der unterschied zwischen cDNA und DNA liegt einfach darin, dass bei der cDNA (complementary DNA) nur noch die Extrons vorhanden sind und die Introns nicht mehr.
Jedenfalls haben wir jeweils 2µg unserer RNA hergenommen (wir haben davor natürlich die Mengen in µl berechnet ^^) und mit ~18,5µl Wasser ( wenn wir von Wasser reden, dann meist von einfach oder doppelt gefilterten) auf 20µl aufgefüllt. Folgend haben wir 1µl spezifischen Primer hinzu gegeben und dann bei 68°C für 7min in die PCR Maschine gesteckt mit dem Programm SEXY1. Während das Programm lief haben wir den Mastermix (8-fache Menge damit mir ja genug für unsere 7 Proben haben, für jede Probe gibt es dann 10,5µl Mastermix) zubereitet:
6µl 5x buffer
3µl 0,1M DTT
1µl dNTPs (20mM)
0,5µl SuperScript II (Enzym)
Über Mittag lie´ßen wir das SEXY1 Programm dann 80min bei 42°C laufen und haben dann mit der RNA Hydrolyse begonnen. Dazu haben wir jeweils 10µl NaOH geaddet, für 10min das SEXY2 Programm bei 70°C gestartet und dann zur Neutralisation noch 10µl 0,1M Hcl hinzugeben; schon waren wir fertig!
Dann durften wir heute noch, mit Hilfe von Markus, unsere Zellen spalten, was so viel heißt, dass wenn die Zellen in der Flasche den Boden bedeckt haben und sich schon verdichtet und zu Kügelchen geformt haben, tja dann ist es Zeit für diese Sorte von Zellen (menschliche Hautzellen) gespalten zu werden. Nachdem wir das Medium in unseren Flaschen abgesaugt haben und PBS (eine Bufferlösung) hinzu gegeben (7ml) haben, danach wieder wegpipettiert haben und erneut ein bisschen (2ml) hinzu gegeben haben, damit unsere Zellen dann nicht austrocknen, haben wir noch ein Enzym (ich glaube Primase war der Name) geaddet, das unsere Zellen „verdauen“, also vom Flaschenboden lösen sollte. Wir haben dann kurz in den Incubator gestellt damit sich das Enzym optimal entfalten kann und durften dann unsere Zellfetzen noch einmal unter dem Mikroskop betrachten; denn dann wurden sie noch ein paar mal pipetterit damit sich auch noch die Zellfetzen vereinzeln. Dann haben wir 2 weitere Bottles mit Medium vorbereitet und dann Zellen aus den einen Fläschchen aufgesaugt (bei mir ~2,5ml; gespalten also im Verhältnis 1:5) und haben sie dann vorsichtig in das andere Fläschchen gespritzt. Abschließend wurden die neuen Fläschchen dann in den Incubator gestellt damit sie wieder wachsen. Wir haben heute also das Grundprinzip für die Zellspaltung vermittelt bekommen.
Ach ja, nicht zu vergessen; man sieht ja so einiges wenn man in einem Labor ist, unter anderem auch die Abfälle. Also ein Bild, das wohl ewig in meinem Kopf bestehen wird, sind die Virusabfälle; braun, schleimig, mit weißen Klümpchen...=S ...also nichts, das man gerne trinken würde, angesehen davon, dass sie giftig sind. Naja, man kann natürlich nicht nur die schönen Dinge im Gedächtnis behalten....
Bis morgen dann!! ^^
Der unterschied zwischen cDNA und DNA liegt einfach darin, dass bei der cDNA (complementary DNA) nur noch die Extrons vorhanden sind und die Introns nicht mehr.
Jedenfalls haben wir jeweils 2µg unserer RNA hergenommen (wir haben davor natürlich die Mengen in µl berechnet ^^) und mit ~18,5µl Wasser ( wenn wir von Wasser reden, dann meist von einfach oder doppelt gefilterten) auf 20µl aufgefüllt. Folgend haben wir 1µl spezifischen Primer hinzu gegeben und dann bei 68°C für 7min in die PCR Maschine gesteckt mit dem Programm SEXY1. Während das Programm lief haben wir den Mastermix (8-fache Menge damit mir ja genug für unsere 7 Proben haben, für jede Probe gibt es dann 10,5µl Mastermix) zubereitet:
6µl 5x buffer
3µl 0,1M DTT
1µl dNTPs (20mM)
0,5µl SuperScript II (Enzym)
Über Mittag lie´ßen wir das SEXY1 Programm dann 80min bei 42°C laufen und haben dann mit der RNA Hydrolyse begonnen. Dazu haben wir jeweils 10µl NaOH geaddet, für 10min das SEXY2 Programm bei 70°C gestartet und dann zur Neutralisation noch 10µl 0,1M Hcl hinzugeben; schon waren wir fertig!
Dann durften wir heute noch, mit Hilfe von Markus, unsere Zellen spalten, was so viel heißt, dass wenn die Zellen in der Flasche den Boden bedeckt haben und sich schon verdichtet und zu Kügelchen geformt haben, tja dann ist es Zeit für diese Sorte von Zellen (menschliche Hautzellen) gespalten zu werden. Nachdem wir das Medium in unseren Flaschen abgesaugt haben und PBS (eine Bufferlösung) hinzu gegeben (7ml) haben, danach wieder wegpipettiert haben und erneut ein bisschen (2ml) hinzu gegeben haben, damit unsere Zellen dann nicht austrocknen, haben wir noch ein Enzym (ich glaube Primase war der Name) geaddet, das unsere Zellen „verdauen“, also vom Flaschenboden lösen sollte. Wir haben dann kurz in den Incubator gestellt damit sich das Enzym optimal entfalten kann und durften dann unsere Zellfetzen noch einmal unter dem Mikroskop betrachten; denn dann wurden sie noch ein paar mal pipetterit damit sich auch noch die Zellfetzen vereinzeln. Dann haben wir 2 weitere Bottles mit Medium vorbereitet und dann Zellen aus den einen Fläschchen aufgesaugt (bei mir ~2,5ml; gespalten also im Verhältnis 1:5) und haben sie dann vorsichtig in das andere Fläschchen gespritzt. Abschließend wurden die neuen Fläschchen dann in den Incubator gestellt damit sie wieder wachsen. Wir haben heute also das Grundprinzip für die Zellspaltung vermittelt bekommen.
Ach ja, nicht zu vergessen; man sieht ja so einiges wenn man in einem Labor ist, unter anderem auch die Abfälle. Also ein Bild, das wohl ewig in meinem Kopf bestehen wird, sind die Virusabfälle; braun, schleimig, mit weißen Klümpchen...=S ...also nichts, das man gerne trinken würde, angesehen davon, dass sie giftig sind. Naja, man kann natürlich nicht nur die schönen Dinge im Gedächtnis behalten....
Bis morgen dann!! ^^
