Auch an diesem Tag sorgen wir für Protein-Sample-Nachschub, wobei wir erstmals alle Arbeitsschritte völlig selbstständig durchführen durften.
Wie immer wurde das EGS eingewogen und anschließend das Chloroform hinzugefügt. Danach gaben wir die nötige Menge an Triethylamin hinzu und legten das Aptes-beschichtete Mica für mehrere Stunden in das Gemisch.
Nach der Wartezeit lagerten wir das Mica dreimal für mehrere Minuten in Chloroform und trockneten es schließlich mit Stickstoff.
Ebenso stellten wir eine Protein-Pufferlösung her, von der wir einige Tropfen auf das Mica pipettierten und bereits kurze Zeit nach dem Auftragen feststellen konnten, dass einige der Proteine bereits eine Bindung eingegangen sind und so mit Hilfe der Oberflächenspannung einen schönen, kreisrunden Tropfen bildeten, der als gutes Omen für die folgende Messung gewertet werden darf.
Erneut hieß es Geduld zeigen und warten. Nach der zweiten Warteperiode wuschen wir das Mica mit Puffer und lagerten es bis zur Weiterverwendung im Kühlschrank ein.

Unsere zweite Forschungswoche beginnt wieder mit der Herstellung von Protein-Samples, wie schon am Tag 4 beschrieben.
Ansonsten beschäftigten wir uns heute mit der Auswertung der Loading-Rates, welche wir die Woche zuvor aufgezeichnet hatten.
Für die Loading-Rate gilt folgendes:

r = k(eff) v

v = s / t

k(eff) gibt die effektive Federkonstante an und v wird einfach aus den eingestellten Messdaten errechnet.

Beispiele:

Cantilever bewegt sich 200nm zur Probe hin und entfernt sich ebenso 200nm. Dies geschieht innerhalb von 0.5sec.
Folglich schließen wir darauf, dass wir einen Weg s = 400nm und eine Zeit t = 0.5sec haben.
Es ergibt sich:

v = 400nm / 0.5sec

v = 800nm / sec

Je höher die Geschwindigkeit, desto geringer ist die Chance auf ein Binding, aber desto größer ist die Kraft, die den Ligand-Rezeptor-Komplex wieder trennt.
Für niedrige Geschwindigkeiten gilt das umgekehrte Prinzip: Höhere Chancen auf ein Binding, aber eine geringere, einwirkende Kraft.

An diesem Tag stellten wir Protein-Samples her: Zuerst badeten wir unsere Aptes-beschichtetes Micas in einem EGS-Chloroform-Gemisch, wobei das EGS als Linker dient. Anschließend gibt man den Katalysator Triethylamin bei. Zu beachten ist hier, dass es sich um eine plastikauflösende Substanz handelt, weswegen unbedingt eine Glaspipette zu verwenden ist. Es folgt eine mehrstündige Wartezeit, damit sich das EGS gut am Mica anlagern kann, sowie eine Trocknung durch Stickstoffgas.
Danach werden die Micas mehrmals einer Waschung mit Chloroform unterzogen, um überschüssiges EGS zu entfernen. Das Ergebnis ist ein reaktionsfähiges, EGS-beschichtetes Mica.
Im nächsten Schritt wird ein Protein-Puffer-Gemisch auf das Mica aufgetragen und es folgt erneut eine mehrstündige Wartezeit. Nun muss das Mica wieder mit einer Pufferlösung abgewaschen werden und wird letztendlich im Kühlschrank aufbewahrt, bis die nächste Messung ansteht.
Ebenso übten wir uns im Einspannen des Cantilever-Chips in die Nase, was sich als nicht ganz einfach herausstellte, da der Chip gerne durch die Gegend springt (und dabei kaputt geht), falls man ihn nicht richtig positioniert oder einspannt.

Der heutige Tag begann mit dem erneuten Versuch Loading-Rates für 300nm - 1sec -10°C zu bekommen. Anfänglich konnten wir einen guten Datensatz mit 1000 Kurven aufzeichen, doch als wir andere Geschwindigkeiten aufzeichnen wollten kam es, wie bereits gestern, zu Fehlermeldungen.
Wir nehmen an, dass der Schrittmotor des AFM ein Signal aussendet, welches die Deflection verfälscht und somit das Einstellen des passenden Setups erschwert bzw. sogar verhindert.
Dennoch war es nach einigen weiteren Fehlversuchen möglich, sämtliche angestrebten Loading-Rates aufzuzeichnen.
Darüberhinaus übten wir uns heute im Pipettieren und informierten uns über Pufferlösungen sowie deren Funktionsprinzip.

Heute wollten wir eine AFM-Messung der gestern hergestellten Protein-Samples durchführen, welche jedoch kaum brauchbare Kurven hervorbrachte, da bei der Ausrichtung des Lasers vermutlich zweimal die Chips beschädigt wurden.
Auch beim dritten Versuch gelang es nicht brauchbare Werte aufzuzeichnen.
Allerding hatten wir so die Möglichkeit, die Einstellung des Setups und die Funktionsweise des AFM noch genauer erläutert zu bekommen und ebenso wurden wir auf mögliche Fehlerquellen, die im Rahmen einer Messung auftauchen können, hingewiesen.

Da ich gestern noch kein Internet zur Verfügung hatte, folgt heute der Nachtrag des gestrigen Tages.
Der erste Praktikumstag begann mit der freundlichen Begrüßung durch die Beschäftigten des Instituts und im Anschluss wurden wir sogleich durch sämtliche, für uns relevanten Arbeitsräume und Labors geführt. Nebenbei wurden vorangegangene Forschungsprojekte vorgestellt, welche uns mit Hilfe von Plakaten gut erklärt wurden.
Danach werteten wir zusammen mit einem Bachelor-Studenten einen Datensatz, bestehend aus 1000 Kraft-Abstands-Kurven, die er im Lauf der letzten Woche mit Hilfe des AFM gewonnen hatte, aus.
Das Rasterkraftmikroskop (engl. Atomic Force Microscope, AFM) wird vor allem zur Visualisierung von Biomolekülen und komplexen biologischen Systemen herangezogen, da man in wässriger Lösung unter physiologischen Bedingungen messen kann. Dies ermöglicht Informationen über Funktion und Struktur von Biomolekülen in deren natürlichen Zustand.
Im Prinzip funktioniert ein AFM ähnlich wie ein Plattenspieler, bei dem eine Nadel die Rille der Schallplatte abtastet. Beim AFM rastert eine auf einer Blattfeder montierte Spitze die Oberfläche einer Probe ab, wobei ein von oben auf die Blattfeder gerichteter Laser die Verbiegung misst, welche das Höhenprofil der Probe direkt wiedergibt.
Um molekulare Wechselwirkungen, d.h. Kräfte zwischen einzelnen Molekülen, untersuchen zu können, muss ein einziges Molekül (Ligand) chemisch an die AFM Spitze gebunden werden.
Um molekulare Kräfte zwischen Ligand und Rezeptor (auf der Probe) zu messen, wir die mit dem Ligand besetzte AFM-Spitze an eine mit Rezeptoren beladene Oberfläche angenähert.
Befindet sich die Spitze in Kontakt mit der Rezeptoroberfläche, bindet der Ligand an einen Rezeptor. Wird nun die AFM-Spitze von der Oberfläche entfernt, übt man auf den entstandenen Ligand-Rezeptor-Komplex solange eine Zugkraft aus, bis die Bindung bei einer kritischen Kraft abreißt und der molekulare Komplex dissoziert.
Des Weiteren beobachteten wir die Herstellung von Protein-Samples (Chimeric Avidin), welche für die Messung am folgenden Tag notwendig waren.

Hallo! Ich heiße Daniela Reichinger, bin 17 Jahre alt und komme aus Aspach. Derzeit besuche ich das BORG in RIed i.I.
Während meiner 4-wöchigen Praktikumszeit bin ich am Biophysik-Institut der JKU in Linz beschäftigt und werde von Dipl. Ing. Martina Rangl betreut.