An meinem letzten Tag habe ich die Bakterien, welche die DNA tragen, zur längeren Aufbewahrung bereitet. Dazu habe ich einen Teil der Suspension mit Glykol gemischt. Bei -80°C können die Bakterien nun ein paar Jahre aufbewahrt werden.

Am Donnerstag habe ich das Ergebnis der Sequenzierung erfahren: Diesmal hat die Ligation funktioniert und die DNA hatte die richtige Basenfolge. Ich habe noch eine Bakterienkultur in eine Nährlösung gesetzt, um sie am nächsten Tag konservieren zu können. Anschließend habe ich alle Geräte weggeräumt, auf denen noch Bakterien vorhanden waren.

Heute war ich wieder im Patch-Clamp-Labor. Ich konnte einzelne Zellen unter einem Mikroskop mit einer Pipette fixieren und mit Elektroden den Ionenstrom durch die Zellmembran messen. Dazu bringt man die Pipette zuerst so nahe wie möglich an die Zelle heran, wobei man ständig den elektrischen Widerstand zwischen Pipettenspitze und Medium misst. Wenn der Widerstand stark ansteigt, sitzt die Pipette direkt auf der Zellmembran. Anschließend saugt man mit dem Mund durch die Pipette an, bis die Zelle von dieser zerstochen wird. Danach lässt sich – wenn alles richtig funktioniert hat – der Ionenstrom messen.

Die Ergebnisse der Sequenzierung werden morgen kommen.

Die Vermehrung hat wieder funktioniert. Wie bereits am Montag, 2. Woche gewann ich wieder die DNA aus den Bakterien und untersuchte sie. Anschließend schickte ich eine Probe zur Sequenzierung.

Der Test durch Verdau ist nun auch fertig. Beim Verdau mit den Enzymen KpnI und XbaI entstanden wie erwartet zwei Banden. Zur Kontrolle führten wir diesmal einen zweiten Verdau mit den Enzymen KpnI und NheI durch, damit wir nicht wieder einen Hefevektor verwenden. Wir erwarteten, dass die DNA dadurch in ein langes und ein sehr kurzes Fragment gespalten wird. Nach der Gelelektrophorese konnten wir aber ein langes und zwei kurze Stücke erkennen. Nachdem wir die Schnittstellen nochmals durchgesehen hatten, wussten wir den Grund: Im Vektor befindet sich eine zweite Schnittstelle für NheI, welche wir vorher nicht bemerkt hatten.

Die Ligation hat also mit ziemlicher Sicherheit funktioniert. Übers Wochenende lassen wir die Bakterien dieser fünf Proben wachsen, damit wir am Montag viel DNA daraus gewinnen können.

Die Bakterien sind hervorragend auf der Platte gewachsen. Von einer Vielzahl an Kolonien haben wir dreißig zur weiteren Analyse verwendet. Dabei gingen wir wieder wie am Freitag, 1. Woche vor. Nach der Überprüfung der Länge begannen wir den Test durch Verdau mit fünf der dreißig Proben, die das beste Bild lieferten. Die Gelelektrophorese werden wir morgen durchführen.

Außerdem habe ich heute das Ergebnis der Sequenzionsanalyse der Probe erfahren, welche ich am Montag, 2. Woche hergestellt habe. Es hat sich herausgestellt, dass die Bakterienkolonie aus einem anderen Labor mit Hefesporen verunreinigt war. Daher ist das, was ich für den Vektor YFP und DNA gehalten habe, in Wahrheit ein Hefevektor und für dieses Experiment unbrauchbar.

Nachdem ich am Montag den Vektor vorbereitet hatte, konnte ich nun ligieren. Dazu habe ich wieder die verdaute DNA mittels Geleletrophorese aufgetrennt und das benötigte Insert herausgesucht. Das Gel habe ich mit der DNA eingeschmolzen und anschließend die DNA herausgefiltert. Schließlich habe ich die DNA mit dem Vektor ligiert. Nach einer Stunde (während dieser Zeit hat die DNA-Ligase hoffentlich gearbeitet) habe ich mit der Transformation in kompetente Bakterien begonnen. Zuletzt habe ich die Bakterien wieder auf eine Platte aufgetragen.