Meine Betreuerin kennt sich speziell mit dem Smith-Lemli-Opitz-Syndrom (SLOS) sehr gut aus, da sie selbst viel darüber erforscht und nicht wenige Paper veröffentlicht hat. Da ich zuvor noch nie von SLOS gehört hatte, nützte ich die Zeit des Wartens zwischen einzelnen Arbeitsschritten (und davon gab es genug: warten bis der Thermocycler mit der PCR fertig ist, warten, dass das Gel fest wird, warten bis die Gelelektrophorese fertig ist, warten bis das Mittagessen in der Mikrowelle warm ist ;-) ), um mich ein bisschen in das Thema einzulesen. Das Syndrom beruht auf einer Mutation im DHCR7-Gen auf dem Chromosom 11 und wird autosomal rezessiv vererbt. Aufgrund von Mutationen in diesem Bereich kommt es zu einer Störung der Cholesterolsynthese. Da Cholesterol (das zum Beispiel ein wichtiger Bestandteil der Plasmamembran und Vorstufe für viele Hormone ist) fehlt, kommt es zu Fehlbildungen und Funktionsstörungen. Je nachdem, um welche Mutation es sich handelt, treten unterschiedliche Krankheitsbilder auf. Sehr häufige Symptome sind Polydaktylie, zusammengewachsene zweite und dritte Zehen, Mikrozephalie (ein kleiner Kopf), verschiedene Anomalien von Herz und Nieren, Wachstumsstörungen, sowie mentale Retardation. Manche Mutationen sind nicht mit dem Leben vereinbar und die Embryonen sterben schon im Mutterleib ab. Behandelt wird mit einer erhöhten Gabe von Cholesterol. Ein großer Teil meiner Arbeit bestand darin, PCRs zur Diagnostik von SLOS durchzuführen.

Polymerasekettenreaktion (PCR): Bei der Polymerasekettenreaktion wird ein Stück der DNA vervielfältigt. Man mischt zuerst einen Mastermix aus Nukleotiden, Polymerase, Pufferlösung, Q-Solution und Primern (jeweils forward und reverse) und setzt dann die zu vervielfältigende DNA ein. Im Thermocycler gehen die DNA Stränge wegen der Hitze auf, die Primer docken an die passenden Stellen an und die Polymerase kommt und baut den jeweils entgegengesetzten Strang dazu. Dies geschieht oft hintereinander in mehreren Zyklen, wobei die Menge der DNA dabei exponentiell vermehrt wird.

Die Beschriftung bezieht sich auf Bilder, die im Album zu finden sind! 1) Agarosepulver wird mit TBE-Puffer (TRIS, Borsäure, Titriplex III) vermischt und aufgekocht. 2) Ethidiumbromid kommt als Farbstoff hinzu. Es soll die DNA später unter UV-Licht sichtbar machen. 3) Die Flüssigkeit muss polymerisieren (zu einem Gel werden). Mit den Kämmen sorgt man dafür, dass kleine Taschen entstehen, die man später mit DNA füllen kann. 4) und 5) Die Taschen werden mit einer Leiter (dient als Vergleich zur Bestimmung der Größe der DNA-Stücke) und den PCR-Produkten (= vervielfältigte DNA) gefüllt. 6) Durch das in TBE-Puffer liegende Gel wird Strom geschickt. Da die DNA negativ geladen ist, wandert sie durch das Gel zur positiv geladenen Anode. Je nach Größe wandern die DNA-Stücke unterschiedlich schnell: Kleine wandern schneller, da sie sich leichter durch das gitter- beziehungsweise netzartige Gel (ich stelle es mir von der Struktur wie Stahlwolle, die man zum Töpfeputzen benutzt vor) hindurchzwängen können, große Stücke wandern langsamer und bleiben etwas zurück. 7) Unter UV-Licht kann man die Banden der verschieden großen DNA-Stücke detektieren.

Mit einer einfachen PCR lassen sich auch Deletionen in der AZF-Region des Y-Chromosoms finden. Solche Deletionen führen zu Oligozoospermie (wenige Spermien sind vorhanden) oder zu Azoospermie (keine Spermien sind vorhanden). Für den behandelnden Arzt ist es wichtig, genau zu wissen, welche Region gelöscht ist, da manchmal durch eine Operation unfertige Spermien entnommen werden können, die dann zur Befruchtung verwendet werden können. Zur Kontrolle, ob die PCR funktioniert hat, untersuchte ich auch immer die Regionen ZFY und SRY, die bei jedem Mann vorhanden sein müssen.

Bei Cystischer Fibrose ist ein genetischer Defekt am Chromosom 7 dafür verantwortlich, dass es zu vermehrter Bildung von zähflüssigem Schleimsekret, vor allem in den Atemwegen und im Verdauungstrakt, kommt. Dadurch kommt es oft auch noch zu bakteriellen Infektionen wie Lungenentzündung. Eine meiner Aufgaben war es, die Mutation im Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gen mittels einer allelspezifischen PCR zu suchen. Es sind über 700 Mutationen bekannt, aber meist wird nach ∆F508 im Exon 10 gesucht, da dies die in Deutschland und Österreich am weitesten verbreitete Mutation ist.

Das Prader-Willi-Syndrom (PWS) beziehungsweise das Angelman-Syndrom (AS) zu diagnostizieren, war etwas schwieriger als die anderen Diagnostiken, da es bei diesen Erkrankungen nicht nur auf den Code der DNA, sondern auch auf deren Methylierung (man nennt diesen Mechanismus der elterlichen Prägung Genomic Imprinting) ankommt.
PWS wird vom Vater vererbt: Es prägt sich aus, wenn die Gene am paternalen Allel in der entsprechenden Region nicht transkribiert werden können. Meist handelt es sich um eine Mikrodeletion der gesamten Region, es kann jedoch auch eine uniparentale Disomie oder ein Imprinting Defekt auftreten.
AS wird von der Mutter vererbt: Es prägt sich aus, wenn die Gene am maternalen Allel in der entsprechenden Region nicht transkribiert werden können. Zusätzlich zu einer Mikrodeletion, parentaler Disomie und einem Imprinting Defekt kann AS auch durch eine Mutation in einem Gen (UBE3A) auftreten.
Die Diagnostik der beiden Syndrome kann auf verschiedene Arten (z.B. Mikrosatellitenanalyse oder Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) geschehen. Ich habe jedoch den Methylierungskit der Firma Chemicon zu Hilfe gezogen.

Um ein bestimmtes DNA-Stück, das bei einer PCR vervielfältigt wurde, zu sequenzieren, muss man das, was bei der PCR im Tube entstanden ist, reinigen. Schließlich soll ja nur die gewünschte DNA sequenziert werden, im Tube befinden sich aber auch noch Primer-Reste oder Teile der anfangs eingesetzten DNA. Zur Reinigung pipettiert man die Flüssigkeit aus dem Tube auf Gel in einer Sequenzierplatte. Eine Platte hat immer mehrere mit Gel gefüllte Löcher, damit viele verschiedene DNA-Stücke gleichzeitig sequenziert werden können. Mit Hilfe einer Zentrifuge wird die Flüssigkeit durch das Gel gepresst, wobei das Gel als Filter wirkt: Nicht brauchbare DNA-Stückchen, wie zum Beispiel Primer-Reste gehen durch das Gel, sodass nur die brauchbare DNA zurückbleibt. Nur diese kommt ins Sequenziergerät.
Ausgangsprodukt: ein mit ExoSapIt von Primern und Nukleotiden gereinigtes PCR-Produkt
Mix: ein forward oder reverse Primer + Nukleotide+ alle 4 Fluoreszenz-markierter Didesoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP) (das ist der sog. „BigDye-Mix“ schon versetzt mit Polymerase)+ Puffer + Polymerase
Dann Cyclerprogramm: Denaturieren , Hybridisieren und Polymerisieren wie bei einer PCR

Diese Methode ist erst seit 2002 bekannt und dient der relativen quantitativen Darstellung von bis zu 50 Nukleinsäurefragmenten in nur einem Assay. Mit ihr lassen sich schon anhand kleinster DNA-Mengen (20 ng DNA) größere genomische Rearrangements, die mit der automatischen Direktsequenzierung von PCR-Produkten nicht erfassbar sind, nachweisen. Dazu zählen Deletionen/Duplikationen einzelner Genabschnitte (Exons) beziehungsweise ganzer Gene. Die MLPA ist dabei wesentlich schneller als andere Methoden. Jede der bis zu 40 MLPA-Proben in einem Ansatz besteht aus einer „Target“(= Zielbereich der DNA)-spezifischen Sequenz, einer „Stuffer“-Sequenz definierter Länge und einer M13-Universal-Primersequenz. Die Multiplex-Amplifikation mit einem Fluoreszenz-markierten M13-Primerpaar kann nur nach Ligation der hybridisierten Proben erfolgen. Anschließend werden die Amplifikationsprodukte durch Kapillarenelektrophorese der Größe nach aufgetrennt. Durch das Design der unterschiedlich langen „Stuffer“-Fragmente ist eine Auftrennung von Fragmenten einer Länge zwischen 130 und 480 bp (Basenpaare) möglich. Dosisunterschiede sind durch Reduktion oder Vergrößerung der Peakhöhen und Peakflächen erkennbar.

Ein eigentlich kurzer, aber sehr informativer und spannender Aspekt war die Arbeit mit Versuchsmäusen. Meine Betreuerin hat gerade ein Projekt, bei dem es um die Rolle des Cholesterols bei der Aktivierung der Sonic Hedgehog Signalkaskade geht, laufen. Hedgehog ist ein sehr wichtiges Signalprotein, zu dessen Aufbau jedoch Cholesterol gebraucht wird.
Am Anfang ist smoothend (Smo) von Patched (Ptc) blockiert und kann daher kein Signal ins Zellinnere leiten. Ist jedoch Sonic Hedgehog (Shh) vorhanden, wird die Blockierung von Smo aufgehoben und es wird ein Signal ins Zellinnere geleitet. Dieses Signal ist im Laufe der Embryonalentwicklung sehr wichtig. Fehlt jedoch Cholesterol, ist der gesamte Signalweg gestört und es kommt zu oben genannten Fehlbildungen. Die Frage ist, ob es reicht, dass Smo aktiviert ist, um Fehlbildungen (bei den Mäusen Lungenhypoplasie) zu minimieren. Ziel der Forschung ist es also, Mäuse bei denen Smo durch eine Mutation immer aktiviert ist mit Mäusen, die SLOS haben, zu kreuzen. Wären diese Mäuse dann gesund oder würden ein milderes Krankheitsbild zeigen, wäre die Theorie bestätigt und würde eventuell Ansätze für neue Behandlungsmethoden bringen.