Die Standardmethode DNA oder DNA-Bruchstücke zu trennen, zu identifizieren und zu reinigen ist die Gelelektrophorese mit Agarose-Gelen. Mit der Elektrophorese können Stoffe aufgrund ihrer Ladung (Größe) getrennt werden. Die Technik ist einfach, schnell durchzuführen und in der Lage komplexe Gemische aufzutrennen. Die Position der DNA im Gel kann direkt bestimmt werden. Dazu werden Banden der DNA mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Ethidium-Bromid angefärbt. Auf diese Weise können kleinste Mengen im Bereich von 1ng DNA mit Hilfe von UV-Licht nachgewiesen werden. Der Farbstoff lagert sich zwischen die Basen und absorbiert bei 300 bzw. 360 nm UV-Licht oder übernimmt von der DNA absorbierte Energie von 260 nm und strahlt sie bei 590 nm im rot-orangen Bereich ab.

Die DNA ist bei neutralem pH negativ geladen (Phosphatgruppen), sie wandert deshalb zur Anode. Die Wanderungsrate der DNA im Agarosegel hängt von verschiedenen Faktoren wie der Größe der DNA-Moleküle, der Stärke des angelegten Stroms oder der Agarose-Konzentration ab.

Da mein Praktikum mit dem heutigen Tag endet, habe ich die letzten Tage intensiv genuetzt, um auch die Laborarbeit kennen zu lernen (Gel Elektrophorese). Da ich kommendes Jahr matuerieren werde, nuetze ich die Zusammenarbeit mit dem IMP, um meine Spezialfrage in Biologie zu schreiben. Ich habe die Aufgabenstellung an mein Projekt gekoppelt. Als Nachteil erweisst sich jedoch die Tatsasche, dass man die Genetik erst in der achten Klasse durchnimmt. Wir haben es allerdings trotzdem geschafft und stattliche 20 Seiten vollbracht, exklusive Graphiken, die nochmal ca. 16 Seiten ausmachen. Wenn man noch in kleine Teilaspekte genauer eingehen wuerde, was mehr kein allzu groesser Arbeitsaufwand ist, koennnte man die Arbeit als Fachbereichsarbeit verwenden. Aber ich schreibe meine FBA in Chemie: Energydrinks.
Im naechsten Beitrag werde ich die Arbeit posten und am Wochenende die Graphiken einscannen. Leider ist keine Koppelung mit XMGR (Graphikprogramm in Linux) moeglich, um die Daten einzufuegen.

Da ich im naturwissenschaftlichen Bereich eher auf Chemie konzentriert bin, hat man mir heute angeboten im Labor mitzuarbeiten (im Biozentrum Wien, direkt neben dem IMP). Ich habe die Chance natuerlich genuetzt und mitgearbeitet. Anfangs haben wir die DNA isoliert, mit verschiedenen Puffern gewaschen und anschliessend Gele Platten gegossen. Wir haben die Proben mit Pipetten hineingespritzt und anschliessend in ein Elektrolysebad gegeben. Zur Loesug wurde ein UV-aktiver Stoff gegeben, um die DNA Banden unter dem UV LIcht zu sehen. Leider haben nur zwei Proben richtig funktioniert und jene werden heute ueber Nacht im IMP sequenziert. Sie haben die DNA mit unterschiedlichenen Enzymen (DNAasen - -ase Endung von Enzymwn) aufgespalten, um unterschiedlich grosse Teile zu erhalten. MIchi hat mir angeboten auch in den folgenden Tagen mitzuarbeiten.

Natuerlich habe ich auch im IMP weitergearbeitet und alle interressanten Graphicen gezeichnet. Wir vergleichen zB. Escherichia Coli Bakterien von unterschiedlichen Staemmen und nehmen besonders hohe Peaks unters Auge. Gleich bem ersten Versuch haben wir einen Erfolg eingefahren und eine pathogenen Abschnitt auf der DNA gefunden. Die Abschnitte errechnet mein Programm und gibt sie aus. Man kopiert den jeweiligen Sequenze Abscnitt und laedt ihn auf NCBI Bast und erhaelt aehnlich Bakterien wo an der selben Stelle pathogene Islands sind. Es wird eine Graphic ausgegeben, die die Aehnlichkeit in Farbbereiche unterteilt. Wir haben viele rote Bereich darin (hohe Aehnlichkeit). Die Aufgabe besteht nun weiters nun Vermutungen, warum manche Bakterienstaemme pathogen und andere wieder nicht krankheitserregend sind.

Heute bin ich total erschoepft aus dem verlaengerten WE zurueckgekommen, da mir dei Hitze den Schlaf geraubt hat. Auch meine Betreuer sind aus dem Wanderurlaub zurueckgekehrt und so konnten wir die erbrachten Ergebnisse besprechen. Gleichzeitig habe ich im Internet recherchiert und Informationen ueber GC Gehalt und Sequenze Length herausgesucht. Die Erfahrungen die ich bei der Summerschool sammle, werden gleichzeitig in meine Spezialfrage in Biologie miteinfliessen. So nun zu ein paar Resultaten:

GC-content

In genetics, guanine-cytosine content (GC-content) is a characteristic of the genome of any given organism or any other piece of DNA or RNA. Usually expressed as a percentage, it is the proportion of GC-base pairs in the DNA molecule or genome sequence being investigated. G stands for guanine and C stands for cytosine. The remaining fraction of any DNA molecule will comprise of the bases A (adenine) and T (thymine), such that calculation of a GC-content indirectly calculates the AT-content as well (e.g. 58% GC-content = 42% AT-content). GC-pairs in the DNA are connected with three hydrogen bonds instead of two in the AT-pairs. This makes the GC-pair stronger and more resistant to denaturation by high temperatures, and thus GC-content tends to be greater in hyperthermophiles.

The GC-content is sometimes used to classify organisms in taxonomy. For example, the Actinobacteria are characterised as "high GC-content bacteria". In Streptomyces coelicolor it is 72%. The GC-content of Yeast (Saccharomyces cerevisiae) is 38%, and that of another common model organism Thale Cress (Arabidopsis thaliana) is 36%. Because of the nature of the genetic code, it is virtually impossible for an organism to have a genome with a GC-content approaching either 0% or 100%. A species with an extremely low GC-content is Plasmodium falciparum (GC% = ~20%), and it is usually common to refer to such examples as being AT-rich instead of GC-poor.

Within a long region of genomic sequence, genes are often characterised by having a higher GC-content in contrast to the background GC-content for the entire genome. In particular, the exons of a gene are characteristically GC-rich, whilst the introns are usually AT-rich (GC-poor). More generally, many studies have looked for (and found) patterns of GC-content variation throughout a genome sequence (encompassing both genes and the - often long - intergenic regions that separate them). The function and significance of such variation is unclear. In many prokaryotic organisms the genome is asymmetric: the composition of the strand being continuously replicated (leading strand) and its complementary (lagging strand) show different GC-contents.

In PCR experiments, the GC-content of primers are used to determine their annealing temperature of the to the template DNA.

The GC-content can be measured by several means but one of the simplest methods is to measure what is called the melting temperature of the DNA double helix with a spectrophotometer. The absorbance of DNA at a wavelength of 260 nm increases fairly sharply when the double-stranded DNA separates into two single strands when sufficiently heated. Alternatively, if the DNA or RNA molecule under investigation has been sequenced then the GC-content can be accurately calculated by simple arithmetic.

Heute habe ich mein Wochenpensum erfuellt und habe alle Graphicen zeichnen lasse, mit Slide Laenge 5000 und 100000, ich habe immer die selben Bakterien genommen, so kann man die Graphicen vergleichen. Ab morgen beginnt mein Urlaub, damit in der letzten Woche die Auswertung mit den Betreuern erfolgen kann. Wir haben auch einen Kollegen bekommen, eine Maus vertreibt sich ihre Zeit auf und in Computern. Maeuse lieben Waerme und so wohnen sie im Drucker. Die Graphicen zeigen, dass sich die GC Verteilung in einem Bereich von 3 SIgma betraegt, aber es gibt markante Stellen wo der GC Gehalt besonders hoch oder niedrig ist.

Derzeit lasse ich das Programm mit einer Slide Laenge von 5000 ausfuehren. In der Zwischenzeit habe ich bereits verschiedene Graphiken zeichnen lassen. Die Daten stammen aus dem Programm slide_schleife_results1000.pl. Der Slider zeigt, dass die GC Verteilung auf der Sequenze nicht immer gleich hoch ist. Auf der Graphic sind auch die Abwichung vom Mittelwert ersichtlich, die groesser als 2 Sigma und 3 Sigma sind. Ich habe eine unerklaerliche Endlosschleife im Programm mit der Slider Laenge 100 000. Es scheint was mit der Abbruchbedingung nicht zu stimmen, was wir aber ziemlich sicher ausschliessen koennen. Aber Computer haben bekannlich ihr eigenes Wesen.