Mein erster Arbeitstag startete um 9 uhr morgens im zmf des Landeskrankenhauses in Graz. Mein Betreuer ist Mathias Schittmayr. Meine erste Aufgabe bestand darin herauszufinden, wie man eine schwere Biotin-Protein Bindung auflöst, oh ne das dabei das Biotin zerstört wird....Dazu sollte ich mehrere Proben erstellen, die ich anschließend in einen Behälter einfüllen sollte und unter Strom setzen sollte.....Diese Aufgabe sollte sich als langwieriger herausstellen ,als ich vorher angenommen hat und in null komma nichts war auch schon der erste Arbeitstag vorüber.
Heute beschäftigte ich mich vor allem damit das am vorigen Tage hergestellte Gel zu makieren.
Die Makierung des Gels erfolgt in mehreren Schritten.
Zu Beginn sollte man mit einer Silverstain Lösung das Gel einsäuern, damit sich die Proteine nicht lösen können. Einige weitere so genannte "Wash" sorgten dafür, dass alles dafür vorbereitet wurde das Silver Nitrat die Banden makieren konnte. Die eigentlich Lösung D sorgte dafür, dass das Silver Nitrat an die funktionellen Gruppen gebunden wurde. Das Makieren dauerte beinahe den gesamten vormittag.
In den Wartepausen erklärte mir mein Betreuer, was man unter zweidimensionaler Elektorphoräse versteht. Der Unterschied zwischen einer normalen Gelelektorphoräse und einer zweidimensionalen Elektrophóräse ist, dass man bei der zweidimensionalen einen Streifen mit unterschiedlichen Ph-Werten hinzufügen muss. Die Folge davon ist, dass sich die Proteine nicht nur auf der Bande, sondern auf dem gesamten Gel, den sogenannten isoelektrischen Punkten (=ungeladene) verteilt, die gleichzeitig auch die am schlechtesten löslichsten Punkte sind.
Nachdem das Gel endlich fertig makiert war, fotografierten wir es um anschließend einzelnen vielversprechend interessante Proteine identifizieren zu könen. Anschließend folgte noch ein langwieriger Destaining Vorgang des Gels

Mein Betreuer erklärte mir wie ein Massenspektrometerin den den Grundzügen funktioniert. Grundsätzlich besteht er aus drei teilen: einer Ionisierungsquelle, einem Analysator und einem Detektor, wobei als Ionisierungquelle entweder ein Laser oder ein Elektronenspry dienen kann. Es gibt zwei softwaren (Ms oder Ms^2)die ermöglichen entweder ein größeres Teilchen oder die Massen von Fragmenten von Teilchen zu berechnen.
Der Vorgang: Zu Beginn pipetiert man die Probe auf ein Target, auf dem sich Kalibrationsmittel befindet und wartet bis die Probe trocken ist um sie anschließend in den Massenspektrografen einzuführen. Die Probeteilchen gelangen durch die Ionisierungsquelle in den Analysator, wo sie beschleunigt werden. Grundsätlich gilt: je kleiner das Teilchen, desto größer die Beschleunigung u desto genauer kann die Masse ermittelt werden. Zu Beschleunigung des Teilchens befindet sich am Ende des Analysators ein Spiegel, der bei größeren Teilchen dafür sorgt, dass sie in ihre Fragmente zerfallen.
Mittels Pc und der richtigen Internetseite kann dann anschließend durch die Masse auf die Sorte des Peptids bzw Proteins geschlossen werden.

Prinzip: Die Probe mit der Trägerflüssigkeit wird durch eine "Säule" gepumt --> Auflösung
Die wichtigsten Bestandteile des Systems sind die Pumpe, die zwei Flüssigkeiten zusammenmischt und das Vorventil, welches dazu dient, dass man die Puffer nicht immer umstecken muss. Ein dreiteiliges Verfahren sorgt dafür, dass die Salze bzw. das Flurofor vom Tag (z.B Biotin) getrennt wird.
Anschließend sorgt der Fraction Collector (deutsch =Teilchensammler) dafür, dass in ein Reagenzglas jeweils 0,5ml Probe gelangen.
Qual Detector:: misst wie viel kurzwellige UV-Strahlung durch ein aromatisches Protein hindurchgelangen
Nachtrag Massenspektograf:
Ion-Trap: ein Ion wird ausgewält
Ion Cyclodrom: ist ein Magnet um den sich Ionen bewegen. Je größer die Teilchen desto langsamer bewegen sie sich. -->Jedes Teilchen besitzt eine bestimmte Frequenz, über die dessen Masse ermittelt werden kann.

Heute beschäftigeten wir uns vor allem damit, Enzyme in einer Nährlösung zu beobachten, die ein Pilz benötigt um Zellulose abbauen zu können. Dazu werden die Pilze zunächst filtriert, wodurch ein Überstand zum Vorschein kommt. Anschließend schießt der Pilz Enzyme nach draußen um die Holzschnitzel verdauen zu können. Diese Enzyme zerschneiden die Zellulose in kleine Stücke. Nun kann der Pilz die Zellulose aufnehmen.
Da sich im Überstand sehr viele Enzyme befinden, wird ein mehrphasiges Verfahren benötigt.
In der ersten Phase wird ein Ionentauscher (genauer genommen ein Kationentauscher) am Säulenmaterial mobilisiert. Die Peptide bleiben wegen der elektrostatischen Wechselwirkung am Material hängen. Nun fügt man nach und nach einen Buffer hinzu, der dafür sorgt, dass sich die Peptide wieder von der Säule lösen. (Die nötige Salzmenge im Buffer hängt von der Stärke der Bindung ab)
In der 2-D Phase (reversed-phase-säule)heften sich die hydrophoben Teile von Peptiden an C18 an. Anschließend versucht man durch Acetonnitril nach und nach die Bindung wieder zu lösen. Am PC wird der Vorgang in sogenannten Peaks angezeigt. Große Peaks werden in ihre Fragmente zerschossen. Für große Proteine wird anstatt des C18 C8 verwendet.
Neben der reversed (=umgekehrt) Phase gibt es auch noch die normale Phase, wo Kieselgel als stationäre Phase verwendet wird. Sie funktioniert, wie der Name der reversed Säule schon sagt, umgekehrt zu dieser. Bei ihr lösen sich nämlich alle unpolaren Gruppen (z.B: Kohlenstoff) schneller wie die polaren.
Zu gut daletzt gibt es dann auch noch die Affinität. Hier binden zwei Moleküle (ein Mobilisierbares und ein Tag) stark aneinander. Man gibt anschließend einen Buffer hinzu um die Bindung zu lösen. Alles was nicht bindet wird gesammelt und meist weggeschmießen.
Auch die Bindung von Fluroforen (=Leuchtstoffe) kann man lösen. Allerdings ist dieser Vorgang um einiges komplizierter, weil es kein mobilisierbares Teilchen als Gegenstück zu den Leuchtstoffen gibt. Daher verwendet man Antikörper.

Der Unterschied zwischen einem 1-D und einem 2-D Gel besteht, wie zuvor schon erwähnt, darin, dass man einem 1-D gel einen trockenen Ph-Streifen hinzufügt.
Anschließend bereitet man die Materialproben vor.
Am Beginn fügt man einem 2D rehydration buffer 8mg/ml DTT hinzu. Anschließend verdünnt man die Materialprobe mit diesem Buffer bei 20 Grad Celsius. Zu beachten ist, dass die Probenkonzentration und Buffermenge von der Länge des Streifens abhängt.z. B bei 50ug Proteine benötigt man 125 ul und einen 7 cm langen Streifen. Bei 10 ug Proteine benötigt man hingegen 300ul und einen 17 cm langen Streifen. (auch bei 20 Grad Celsius lagern)
Nun muss die Proben 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf den Schüttler gestellt werden.
Rehydration: (IEF-cell BioRad-active rehydration)
Zunächst bereitet man die Ablegewanne vor. Auch diese ist wieder von der Streifenlänge abhängig. Anschließend pipettiert man die Proben/buffer-Mischung in die Kanäle indem man die Gelseite nach unten plaziert. Die anodische Seite sollte dort liegen wo die Wanne mit plus makiert ist. Anschließend überprüft man ob die Proben gleichmäßig verteilt sind und inkubiert die Streifen 30 Minuten lang. Dann begießt man die Streifen mit Mineralienöl. Dieses soll dafür sorgen, dass das Gel nicht austrocknet. Die aktive Rehydrationsphase ist somit beendet. Man muss nur mehr die Wanne abdecken und die aktive Rehydration läuft bei 50 Volt über Nacht ab.
Die passive Rehydrationsphase läuft hingegen etwas anders ab: Auch hier bereitet man zunächst die Wanne vor und gibt wie bei der aktiven Phase die Proben in die Kanäle, sodass die Gelseite nach unten schaut. Anschließend überprüft man die richtige Verteilung, lässt den Streifen 30 Minuten lang inkubieren, bedeckt die Wanne und rehydiert sie so über Nacht.
Es ist auch möglich, dass die passive Rehydration mit dem IEF-cell von BioRad abläuft. In diesem Fall sollte man nicht den letzten Schritt von der aktiven Rehydration Anleitung durchführen und die Wanne über Nacht gut abdecken. Eine andere Möglichkeit ist auch noch, dass man die Rehydration in der Muliphor 2 Wanne über Nacht gibt und die Festsetzung im IEF-focusing tray ausführt. Das Progamm darf allerdings keine aktiven Rehydrationsstufen beinhalten.
IEF-focusing (=Fixierung)
Dazu bereitet man zunächst die focusing-Wanne vor un plaziert anschließend die nasse IEF Elektroden-Wicken auf den Elektroden (unter die Streifen).Anschließend gibt man die rehydrierten Streifen mit dem Gel nach unten in die Wanne. Das positive Ende des Streifens sollte in die Richtung des positiven Ende der Wanne schauen. Wie zuvor sollte man als nächstes die Streifen mit Mineralienöl bedecken und dann das geeignete Programm auswählen. Eventuell müssen die Wicks während dem Durchlauf gewechselt werden. Dazu muss man die Wanne nach Drücken des Pauseknopfes wegstellen. Zum Fortsetzen des Durchlaufes drückt man den grünen Run-bottom. Der Run ist dann fertig, wenn die Farbe der Streifen ausgelaufen ist. Sind die Streifen fertig, so sollte man sie bei Minus 80 Grad Celsius lagern oder man fängt sofort mit der zweiten Dimension an.
Multiphor 2 Asherham
Zu Beginn sollte man das Werkzeug für die interessanten Proben vorbereiten. Luftblase sollten in der Wanne vermieden werden. Wichtig ist, dass die Wanne genug Mineralienöl beinhaltet weil sonst das Gel austrocknet.
Als nächsters gibt man die rehydrierten Streifen mit der Gel Seite nach oben in die Wanne. In dieser Wanne sind kleine Hügel und auch die Einlägefächer sind nicht gut sichtbar. Mithilfe eines kleinen Spatels muss der Streifen in der Wanne positioniert werden. Die Hügel befinden sich zwischen den Streifen. Das Plus Ende vom Streifen wird in der Nähe der anode (rot) positioniert. Anschließends positioniert man nasse Elektrodenwicks auf die Ecken der Streifen und bedeckt den Streifen mit Mineralienöl. Nun wält man das geeignete Programm aus. Es kann sein, dass man die Wicks zwischen dem Durchgang wechseln muss. Der Durchgang ist dann fertig, wenn sich die Farben entfärbt haben. Die erste Dimension ist nun fertig. Für die Lagerung sollte man die Streifen in passende Behälter bringen und bei -80°C lagern. Allerdings ist keine Pause unbedingt nötig. Das heißt, dass man auch sofort eine zweite Dimension anfangen kann.

Die zweite Dimension
Der Gelabstich
Für den nächsten Schritt benötigt man ein vorgefertigtes SDS Gel, welches man 0,5cm(4ml) unter das obere Ende gießen sollte.
Reduction und Alkylation
Als nächsten Schritt gibt man die Streifen für 15 Minuten in einen Behälter mit Reaktionsbuffer. Die Menge des Buffers, wie zuvor schon erwähnt hängt von der Streifenlänge ab. Dann nimmt man einen Streifen heraus und lässt in abtropfen. (In diesem Schritt is es besonders wichtig das Gel nicht zu berühren). Die Prozedur sollte man mit einem neuen Behälter, der mit Alkylation Buffer gefüllt ist, für 15 min wiederholen.
Länge des Streifens 7 cm 11cm 17 cm 18 cm 24 cm
Rehydrationsbuffer 2,5mL 4 mL 6mL 6mL 8 mL
Alkylationsbuffer 2,5mL 4 mL 6mL 6mL 8mL

Nun lässt man die Streifen austrocknen und gibt man sie anschließend in einen Behälter mit running buffer.

Das Gelladen
Zunächst erhitzt man die Argarose für 10 Minuten bei 60°C. Dann pipettiert man die Agarose auf das Abguss Gel. 200 ul ist ausreichend für 11 cm Streifen, 1000 ul für 24 Streifen. (Die Agarose dient dazu den Streifen und das Gel zu verbinden)
Als nächsten Schritt gibt man den Streifen so weit wie möglich zum Beginn des Abgussgels direkt in die Agarose hinein. (Bei diesem Vorgang muss man sehr vorsichtig sein. Man verwendet dazu am besten einen kleinen Spatel um das Gel nicht zu verletzten. Luftblasen sind unerwünscht). Der Durchgang kann erst gestartet werden, wenn die Agarose trocken ist.(15 min). Es ist wichtig, dass die Agarose wirklich trocken ist , andernfalls wird sich die Agarose im Buffer auflösen.

Durchgangszustände für die zweite Dimension
Man sollte die Wölbung auf 10 bis 20°C herunterkühlen.

Phase 1: 5mA für 2 Stunden
Phase 2: 11 cm Gel 3W/Gel 1 Stunde
4W/Gel ca.3 Stunde
24cm Gel 17-20W/Gel ca.5Stunden

Bereite die zehnfach gefaltete Lösung von 10 Krypton Protein Färbung und gleiche es auf Raumtemperatur ab. Fixiere das Gel für 5 Minuten mit einer Fixing Solution( 30ml ethanol,10ml acetic acid gl.,60 ml H2O). Anschließend gießt man Fixing Solution ab und wiederholt den Vorgang. Wieder gießt man die Fixing Solution ab und wäscht das Gel 1 min lang mit destilliertem Wasser. Dann gießt man das Wasser ab und fügt Krypton Protein Stain hinzu und schüttelt das Ganze für 15 Minuten. Dies ist der eigentliche Färbungsvorgang. (Achtung Krypton ist ein Flurofor! Während dieses Vorganges müssen die Proben abgedeckt werden.) Der Färbevorgang wird durch eine Destaining Solution(5 ml acetic acid+95 ml dest. Wasser) beendet. Das Gel wird dabei mit der Destaining Solution 3 Minuten geschüttelt.