so...ich musste heute schon um 4 uhr in der früh aufstehen weil ich noch nach salzburg fahren musste...und sitze seit halb 9 jetz in meinem büro an der uni und muss jetz meine protokolle schreiben...Versuche werde ich diese woche keine mehr machen...aber ja...
ich bin müde und mein kopf denkt nicht mit...aber was solls
meine oma hat immer gesagt:" Maul halten und weitergehn"
das werd ich jetz auch machen... einfach weiterschreiben...
:)

hey leute!
also heute war eig das haupttema klonieren also verdauen.
Wie es so üblich ist beim Klonieren braucht man einen Vektor und ein Insert. Der Verdau des Vektors bestand bei uns aus NTAP, Puffer 4, FSeI, BSA und dH2O. zuerst wurde das ganze bei 37° inkubiert danach wurde umgepuffert. umpuffern tut man hauptsächlich dafür, dass der puffer, FseI und BSA wegfallen und nur mehr die reine DNA vorliegt. die DNA wurde dann wieder Verdaut mit 20mM dNTPs, T4- Polymerase und Puffer 2. die Polymerase erzeugt mit dem dNTPs ein blunt end am vektor das braucht man dann später bei der ligation. das ganze wurde dann für 20' in ein eisbad gestellt damit die reaktion auch gut verläuft. danach kam das ganze in ein agarosegel und wurde nach den 20' ,in der das gel gelaufen ist, ausgeschnitten (also die DNA bande) und eluiert. eluieren bedeutet soviel wie umpuffern. dann stellten wir noch einen verdau her diesmal mit puffer 3, BSA und NotI und natürlich auch DNA. NotI wird verwendet damit sich an einem ende des Vektors ein stick end bildet was dann sehr wichtig für den insert ist, damit der nicht falsch reinkommen kann...der insert braucht aber natürlich auch ein blunt und ein sticky end mit der gleichen basensequenz.. das ganze wurde dann wieder für 1h inkubiert danach auf ein agarosegel aufgetragen und nach 30' wieder eluiert danach kam dann noch ein kontrollgel bei dem allerdings irgwas nicht hinhaute denn plötzlich hatten wir keine DNA mehr.
das gleiche wird auch mit dem Insert gemacht. Unser insert war Gli2 full das zuerst PCR gefahren wurde. zum verdau kam dann auch noch Puffer 2, ECORV (dient zur bildung eines blunt ends)und wieder BSA. nach einer stunde inkubiern wurde das ganze umgepuffert . der verdau hat jetz DNA, Puffer3, Not I (um das passende gegenstück des sticky ends zum vektor zu bekommen) und BSA (das braucht das enzym is aber nicht im puffer enthalten und muss somit so dazu gegeben werden.
das ganze kommt dann auf ein agarosegel wird nachdem das gel gelaufen ist wieder eluiert und dann kommt ein kontrollgel.

Wie vorhin schon gesagt hatten wir bei dem Kontrollgel keine DNA mehr. weder vom gli2 noch vom Ntap. und auch beim fotometer machen zeigte es uns keine DNA an.

nichts desto trotz machten wir heute zum schluss noch die ligation. für eine ligation braucht man eine ligase, einen ligasepuffer, den vektro das insert und den rest mit dH2O auffüllen.
das ganze zusammenpipetiren und dann über die nach in einem 4°C kalten wasserbad stehen lassen.
das wars dann für heute...

bin ziemlich müde und genervt weil ich die protokolle noch schreiben muss

man liest sich
lg

hey mal an alle...endlich hab ichs auch geschafft dass ich meine blogs hier veröffentlichen kann...
bin zwar schon eine woche hier aber es geht erst heute...

also zu dem was ich die letze woche so gemacht habe...es waren einigemale kontrollverdaue dabei und einmal eine trafo + kontroll verdau...wir wollen ja schließlich sehn ob noch alles passt...

und heute haben wir die zellen, die wir gestern ausgesäht haben für unseren luci, in ein neues medium gegeben um morgen bzw übermorgen daran weiter arbeiten zu können.

ansonsten haben wir heute nicht viel gemacht...viel herum gestanden, ein paar neue lösungen hergestellt und das wars dann auch schon...