Ort: Institut für Angewandte Genetik und Zellbiologie d. Universität für Bodenkultur Wien (Muthgasse 18, 1190 Wien)
Dauer: 03.07.2006 – 28.07.2006

Forscherteam von Dr. Marie-Theres Hauser
Betreuerin: Nicole Schlager

Pflanze, mit der gearbeitet wird: ARABIDOPSIS THALIANA

kurze Beschreibung meines ersten Projekts:
Es gilt mittels Doppelmutantenanalyse der Erkenntnis welche Funktion das zur Genfamilie VSP2 gehörende Gen VPS2.3 besitzt, ein wenig näher zu kommen. Dazu werden mutierte Pflanzen verschiedener Linien und Kreuzungen ausplattiert, phänotypisiert und genotypisiert.

DNA-EXTRAKTION (mini-prep): 1. Methode

1) Materialien: Tris HCl, EDTA, Guanidin HCl, NaAc, steriles Wasser, Isopropanol, Ethanol 100 %, NaCl

2) Vorgangssweise
Zunächst werden die drei Pufferlösungen (Extraktionspuffer, Waschpuffer 1 und 2) vorbereitet und gut mittels Vortexen vermischt. Dann bereitet man 38 Eppis (Gefäßchen für Proben) vor und pipettiert je 3 μl silica (Kügelchen, an die sich DNA bindet) und 30 μl NaAc hinein. Als nächstes müssen die vorbereiteten Proben in flüssigen Stickstoff gegeben und in gefrorenem Zustand mittels einer Art Bohrmaschine homogenisiert werden.
Nach dieser Vorbereitung kann die eigentliche Extraktion beginnen: Die Proben werden mit 1 ml des Waschpuffers versetzt; nach gründllichem Shaken derselben wird der flüssige Überstand, in dem sich nun auch die DNA befindet abgenommen und in die vorbereiteten Eppis überführt. Nach erneutem Vortexten, Shaken und Zentrifugieren kann der Extraktionspuffer entfernt und mit der Waschung begonnen werden. Schritt für Schritt werden die Waschpuffer sowie 100%iger Ethanol beigemengt und nach ausgiebigem Vortexen und Zentrifugieren wieder abgenommen, sodass schlussendlich eine kleine Menge des Endproduktes, die DNA auf den silica-Kügelchen, als weißer Rückstand im Eppi zurückbleibt. Dieser Rückstand muss nun noch in der Vakuumzentrifuge getrocknet und mit TE-Puffer, einer Substanz in der sich die DNA wohlfühlt, versetzt werden. Nach fünfminütigem leichten Shaken bei 55°C können die fertig extrahierten DNAs im Kühlschrank aufbewahrt werden, ehe man sie für die PCR weiterverarbeitet.


DNA-EXTRAKTION (mini-prep): 2. Methode

1) Materialien: 2 x CTAB, Chloroform, Ethanol 100%, Ethanol 70%, TE

2) Vorgangsweise
Wie bei der ersten Extraktionsmethode müssen die eingefrorenen Proben zunächst homogeniesiert werden. Danach versetzt man sie sofort mit 200 μl 2 x CTAB und stellt sie für 5 Min. auf 65° C. Anschließend gibt man unter dem Abzug zu jeder Probe 200 μl Chloroform; die Lösung muss nun nun noch für 3 Min. auf den Shaker und dann für 5 Min. in die Zentrifuge. Der so entstandenen Überstand wird in die vorbereiteten Eppis transferiert und auf Eis gestellt. Nun folgt eine Reinigung desselben mit 500 μl Ethanol absolut. Bevor der dabei entstehende Überstand nach 30-minütigem Zentrifugieren bei einer Temperatur von 4°C wieder abgenommen werden kann, muss die Probe für 20 Min. auf -20° C gestellt werden. Die nächste Reinigung erfolgt mit 70%igem Ethanol. Die Probe muss in diesem Schritt nur mehr für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert werden und beim Abnehmen des Überstandes ist genauestens darauf zu achten, dass auch der letzte Tropfen Ethanol entfernt wird. Nach einer Trocknung der Proben in der Vakuumzentrifuge, wird die DNA mit 30 μl TE-Puffer (pH = 8) versetzt und für 15 Minuten in den Shaker gegeben.


PCR - Polymerasekettenreaktion

1) Materialien:
- MM = Mastermix: 10 x PCR-Puffer, 2 mMdNTPs, 20 μM Primer fw. (1g03950F1), 20 μM Primer (1g03950F1 od. LBa1) rev., steriles Wasser
- TAQ-Poylmerase
- DNA

2) Vorgangsweise:
In einer Eisbox werden entsprechend der Anzahl der Proben kleine Eppis vorbereitet und in jedes derselben 1 μl DNA pipettiert. Dann wird der Mastermix zubereitetet, gut gevortext und abzentrifugiert. Nach Zugabe der TAQ-Polymerase wird die Lösung nur noch mit der Pipette gut durchmischt und danach in die einzelnen vorbereiteten Eppis mit der DNA verteilt (je 9 μl). Bevor die Proben in die PCR-Maschine kommen und das Programm gestartet wird, müssen sie noch kurz in der Zentrifuge abgespinnt werden.

Montag, 03.07.2006
1) allg. Einführung (Einlesen in Projekte, Erklärungen,...)
2) Erlernen d. Pipettierens:
- 1000, 200, 20, 10 μl - Pipetten
- Verhältnisberechnungen
3) DNA-Extraktion (mini-prep): 38 Proben

Dienstag, 04.07.2006
1) Arbeiten mit der Waage (Herstellung eines Mediums f. Pflanzen)
2) Besuch eines Vortrages
3) Einstellen d. pH-Wertes einer Lösung
4) Ausplattieren von Samen
- 6 Proben mit je ~40 Samen
- 6 Proben mit je ~20 Samen
- Platten: MS 4,5 %
5) Besuch einer Vorlesung

Mittwoch, 05.07.2006
1) Erfassen allgemeiner Informationen zu PCR und Gelelektrophorese
2) PCR: 41 Proben, 2 x durchgeführt (unterschiedliche Primer)
3) Gelelektrophorese
- Herstellung d. Agarose-Gele (1%)
- 41 Proben (Proben d. ersten PCR)

Montag, 10.07.2006
1) Gelelektrophorese: 41 Proben (2. PCR vom 05.07)
2) Besuch d. Labor-Meetings
3) Ausplattieren von Samen
- 9 Proben mit ~ 40 Samen => 3 Platten
- MS 1 % + kan (100mg/l)
4) DNA-Extraktion (mini-prep) 40 Proben

Dienstag, 11.07.2006
1) DNA-Extraktion (mini-prep): 20 Proben
2) Besuch eines Vortrags (Akademie d. Wissenschaften)

Mittwoch, 12.07.2006
1) DNA-Extraktion (mini-prep): 20 Proben
2) PCR: 2 x 80 Proben

Donnerstag, 13.07.2006
1) Gelelektrophorese: 38 Proben
2) Arbeiten am Mikroskop

Freitag, 14. 07.2006
1) Gelelektrophorese: 132 Proben
2) Arbeiten am Mikroskop: Pflanzen mit GFP und Wurzelphänotyp suchen
3) Ernten von einzelnen Samenschoten
4) Keimlinge auf Erde setzen

Montag, 17.07.2006
1) Samen ernten
2) Arbeiten am Mikroskop: Pflanzen mit Wurzelphänotyp suchen
3) DNA-Extraktion: 20 Proben

Dienstag, 18.07.2006
1) Samen ausplattieren: 4 Platten (MS 1 %, MS 4,5 % + kan)
2) Pflänzchen aussetzen u. Keimlinge einfrieren
3) PCR

Mittwoch, 19.07.2006
1) GUS-staining (15 Proben, grüne Samenschoten)
2) Gelelektrophorese (48 Proben)
3) PCR (60 Proben)

Donnerstag, 20.07.2006
1) Medium f. Platten herstellen (MS 4,5 %)
2) Gelelektrophorese (48 Proben)
3) Ausplattieren v. Samen (3 Platten; MS 1 % + kan)

Freitag, 21.07.2006
1) PCR (22 Proben)
2) Pflanzen auf Erde setzen (8 x 5 Keimlinge)
3) Herstellung von 2 Gelen 1,5 % für Gelelektrophorese
4) Gelelektrophorese (48 Proben)
5) Ausplattieren von Samen (3 Platten, MS 1% + kan)
6) Samen ernten

Montag, 24.07.2006
1) Gus-staining: Ergebnisse im MIkroskop betrachten
2) Samen ausplattieren: 4 Platten (MS 4,5 % u. MS 1 % + kan.)