An diesem Tag starteten wir gleich 2 Experimente. Beginnend mit der PCR (Polymerase Chain Reaction). Wir nahmen ein menschliches Gen "Patched- Promotor" dazu. Ansatz: 10 ng Template
1 µl Primer Mix
12,5 µl Puffer G (=Nucleotide, Mg²,l etc.)
0,5 µl Failsafe Enzym
10 µl H2O----------> 25 µl ->2X

Primer: 100 pmol/µl ->soll 10 pmol/µl = 1*10
Template: 1 µg/µl ->soll 10 ng/µl = 1 µl + 99 µl H2O
Primer forward: 5 µl
Primer reverse: 5 µl
+ 40 µl H2O = 50 µl

1.Schritt in PCR Maschine bei 95°C (=Denaturierung- DNA Doppelstränge trennen sich) ca. 30 sec.
2.Schritt in PCR Maschine bei 61°C (=Anlagern- kurze Primer binden an einzelsträngige DNA) ca.30 sec.
3.Schritt in PCR Maschine bei 72°C (=Polymerase verlängert die kurzen Stücke in lange->Vermehrung der DNA) ca.30 sec.

Diese 3 Schritte wiederholen sich 25 mal. Danach werden beide Primer und der Marker mind. für 30'' in Agarosegel gepipetiert. Das ergebnis mit den Basenpaaren sieht man dann am UV Schrim.


Das Zweite Projekt an diesem Tag war der Plasmidverdau. Gestern haben wir diesen auch schon gemacht nur hat er nicht so gut funktioniert. Heute haben wir weniger H2O genommen und es war besser auf dem UV Schirm zu sehen. Fotos folgen.

Heute haben wir die gereinigten Plasmide bearbeitet im Restriktionsverdau um sicher zu stellen, dass es sich um das richtige Plasmid (nämlich pGL 3b FST) handelt. Anhand einer Restriktionskarte (=Map) wurden 2 passende Restriktionsenzyme gesucht- Pst I und Xho I. Diese wurden in 1% TAE Agarosegel gegossen (100 ml 1 X TAE + 1g Agarose) und der Restriktionsverdau wurde auf dem Gel aufgetragen um richtige Fragmentgrößen des Plasmids zu erkennen.

1.wir bearbeiteten ein unverdautes Plasmid: 5 µl vom gereinigten Plasmid, 5 µl dH2O (=destiliertes Wasser)
Ziel: heterodimere und homodimere ausschließen

2. wir bearbeiten ein verdautes Plasmid/ Restriktionsverdau: 20 µl Ansatz, 5 µl vom gereinigten Plasmid, 1 µl Pst I, 1 l Xho I, 1 µl Rnase (=dient zum Abbau der RNA), 2 µl Buffer R (= beinhaltet Substanzen, damit die Enzyme verdauen bzw. arbeiten können), 10 µl dH2O

Bei 37 °C wird es auf einen Ehizblock gestellt und für 45' inkubiert. Danach geben iwr in das unverdaute Plasmid 2 LD (= loading dye), in das verdaute Plasmid 4 LD, damit unsere Proben in die Agarosetaschen absinken können, da das Glycerin im LD schwerer ist und absinkt. Wir führern die Gelelektrophorese mit 100 V durch. Da die DNA negativ geladen ist wandert die Substanz somit vom negativen zum positiven Ende. Das Ethidiumbromid wurde zum Agarosegel beigegeben und intekaliert mit der DNA, wodurch diese unter UV- Licht sichtbar wird. 1kb Marker wurde als Referenz verwendet, um die Bandengrößen zuordnen zu können.

Zur Erklärung noch ein paar Details:

Pst I (=isoliert aus Providencia stuarti) schneidet 5' überlappend, Xho I (= isoliert aus Xanthomonas holcicola) schnedet 3' überlappend
1% Agarosegel besteht aus 100 ml 1X TAE und 1g Agarose-wird zusammen 45' in die Mikrowelle gegeben.

Dies war ein spannender Tag und ich freu mich auf morgen.

Als ich erfahren habe, dass ich das Praktikum an der Universität in Salzburg absolvieren darf war meine Vorfreude darauf unbegrenzt. Am ersten Tag wurde mir sogleich jedes Labor mit all den Funktionen gezeigt. Ich erhielt einige Lektüren zum Lesen und konnte es kaum erwarten am nexten Tag mit meiner Laborarbeit zu beginnen.


Heute, also am zweiten Tag meines Praktikums startete ich meinen Tag mit einer Einführung in das neue Projekt. Meine heutige Aufgabe war es ein Plasmid aus einer Bakterienzelle zu lösen, was wie folgt vor sich ging:
Die Bakterienzellen (=Escherichia coli) wurden über Nacht wachsen gelassen. Diese Zellen beinhalten ein Plasmid. Durch Zentrifugation haben wir dieses geerntet und das daraus enstandene Pellet ist in TENS gelöst worden. Dabei ist die Zellmembran aufgegangen und die DNA ist frei geworden. Danach sind die genomische DNA und Proteine ausgefällt worden mit Natriumacetat. Daraufhin wurden sie wieder durch Zentrifugation abgetrennt. Im Überstand war dann die Plasmid DNA und RNA, welche durch Ethanol ausgefällt wurden. Danach haben wir das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet und in Puffer bzw. Wasser gelöst. Derzeit befindet sich das Plasmid im Freezer und muss bis morgen warten.
Ich bin schon sehr gespannt auf morgen und freue mich auf jede neue Aufgabe.