Gestern haben wir eine Gelelektrophorese durchgeführt. Dafür haben wir 30 ml unseres SDS Running Buffers mit 570 ml Wasser in eine spezielle Kammer gefüllt. Das Gel, auf das wir schon unsere Proteine aufgetragen hatten, ließen wir für eine Stunde auf 175 Volt. Dann hben wir die Proteinbanden vom Gel auf eine Membran übertragen und diese dann für eine Stunde gewaschen. Als nächstes haben wir eine Miniprep durchgeführt, bei der Plasmid-DNA von Ecoli-Bakterien isoliert wird. Dafür haben wir Zellen abzentrifugiert und abpipettiert. Danach haben wir 250µl R3-Puffer und 250µl Lysispuffer hinzugetan. Diesen Mix haben wir dann für 5 Minuten ruhen lassen, nach diesen Schrtt haben wir noch 350µl N4-Puffer hinzugefügt und dann zum Schluss abzentrifugiert.

Heute haben wir zuerst unsere HMC und pMSCV Proben zur Sequenzierung verschickt. Danach haben wir unseren Primer-Stock für die PCR vorbereitet. Für den PCR-Mix haben wir Wasser, HF-Puffer, dNTPMix, den Primer Stock, Template DNA, DMSO und Phusion Polymerase verwendet. DIese Mischung haben wir wieder mit drei Phasen behandelt. DIe erste bestand aus 30 Sekunden auf 98'°C. Die zweite wurde wieder 35-mal wiederholt, diesmal waren es 98° für 20 Sekunden und 72° für 50 Sekunden. In der dritten und letzten Phase 3 Minunten auf 72° und zum Schluss auf 4° abgekühlt. Währenddessen haben wir das Agarosegel gegossen, dass aus 0,8 g Agarose und 180 ml TAE-Puffer bestand. Hierzu haben wir dann Ethidiumbromid hinzugetan und das Gel aushärten lassen, um später unsere Proben aufragen zu können.

Heute habne wir uns mit der BCA befasst, eine Art Prroteinebstimmung. Wir haben 50 µl Stock immer wieder halbiert, gevortext und abzentrifugiert, danach mit 5,2 ml Puffer vermengt und eine Verdünnung von 1:50 hergestellt. Dies haben wir dann für 60 Minuten auf 37°C gelagert und danach die Proteinabsorbtion gemessen. Außerdem haben wir 3T3-L1 Zellen gesammelt. Zuerst mussten wir das Medium abgsaugen, mit 2ml PBS waschen und danach noch einmal alles absaugen Nach diesem Schritt pipettierten wir 250 µl Lysis-Puffer hinzu und kratzten die Zellen von den Wells, wobei eine zähflüssige Substanz entstand, die wir dann in Eppis umgefüllt und kühl gelagert haben..

Am Donnerstag haben wir für die PCR zuerst einmal unseren Primer mithilfe einer Formel ausgerechnet und unseren Mastermix zusammengestellt. Dafür haben wir Wasser, dNTP Mix, den Primer, Taq-Puffer KCL, Magnesiumchlorid und eine Taq-Polymerase verwendet. Im nächsten Schritt haben wir diesen Mix in drei Phasen behandelt: In der ersten Phase haben wir diesen Mix für 2 Minuten auf 94°C erhitzt. In der zweiten Phase haben wir diese Mischung auf 94° für 30 Sekunden, auf 68° für 1 Minute und danach auf 72° für 3 1/2 Minuten erhitzt, noch dazu haben wir dies 35 Mal wiederholt. Zum Schluss dann, in der letzten Phase, haben wir diesen Mix für 10 Minuten auf 72° für 10 Minuten und dann auf 4° gesetzt. Nach dieser Aufgabe haben wir das Gel für die Elektrophorese gegossen, für das wir Agarose und TAE 1x Puffer verwendet haben. nach ein paar weiteren Arbeitsschrittn haben wir dann Ethidiumbromid hinzugefügt.
Am Freitag haben wir uns mit der Reinigung der Westernblots beschäftigt und Medium angeimpft. Dafür haben wir 5 ml LB-Medium mit Zellen, die wir von einer Agarplatte gekrtzt haben, vermengt.

Die Hälfte der Woche ist geschafft! Am heutigen Mittwoch haben wir zuerst den Westernblot mit dem PBS-Puffer dreimal für jeweils 10 Minuten gewaschen und danach mit den Sekundärantikörpern neu eingeschweißt. Nach etwa einer Stunde auf der Schüttelplatte, haben wir den Westernblot auf Fotopapier entwickelt. Den vorher erwähnten PBS-Puffer haben wir heute auch selbst hergestellt, dafür haben wir 250 µl Tween 20 in 500ml PBS gelöst.

Am heutigen Dienstag haben wir anfangs den Puffer für die Protein-Gel -Elektrophorese hergestellt. Die Elektrophorese beschreibt die Wanderung elektrisch geladener Teilchen durch einen Stoff, der als Trägerstoff dient, in einem elektrischen Feld. Dafür haben wir Tris, Glycin, Wasser und SDS vermengt und danach den pH-Wert auf 8,3 eingestellt. 19 ml des Puffers haben wir mit 171 ml Wasser vermischt und dann damit ein Gel-Elektrophoresegerät ausprbiert. Nach nicht ganz zwei Stunden haben wir dann das Gel mitsamt der aufgetrennten Proteine auf eine Membran übertragen; hilfreich dafür war ein Puffer aus Wasser, Tris-Chlor und Methanol.

Sowohl letzte Woche Freitag, als auch heute haben wir uns dem Zellen zählen gewidmet. dazu haben wir in zwei Eppis jeweils 40 µl PBS nd 10 µl Tryptanblau gegeben nd einige Male auf und ab pipettiert. Das Tryptanblau dient einzig und allein zur Einfärbung der Zellen, dadurch wird das Zählen erleichtert. Nach dem Färben werden die Zellen auf eine sogenannte Thomazählplatteplatte, auf der sich ein Raster zur Erleichterung des Zählens befindet, pipettiert.