So, ich habe jetzt einiges zu posten:

20.7. : Verena hat die entnommenen Macrophagen mit verschiedenen Reizen stimuliert, wie zum Beispiel LPS (Verbindungen von Fetten und Zuckern die in der äußeren Membran von Bakterien vorhanden sind; sind Erkennungsmerkmal für Immunsystem) um zu sehen, ob sich die Macrophagen normal verhalten, oder in irgendeiner Weise überreagieren. Nachdem wurden die Macrophagen wieder in Ruhe gelassen.
Weiters wurden den ovarektumierten (ab jetzt ovx) Mäusen und den sham Mäusen zur Hälfte ein MPA Pellet und zur Hälfte garnichts implantiert. Die Hälfte der MPA Mäuse bekamen zusätzlich noch Östrogen. Sie werden über drei Tage behandelt. Nach den drei Tagen werden ihnen die Brüste entnommen und Schnitte angefertigt um zu sehen, ob es an RANKL liegt, dass sich das Brustgewebe teilt.
ovx Mäuse können von selbst kein Östrogen erzeugen, da Östrogen in den Eierstöcken produziert wird. Beide, ovx und sham Mäuse werden gleich behandelt. RANKL braucht Östrogen und MPA um induziert zu werden. Also nur in denen, in denen beides vorhanden ist, und somit auch RANKL sollte sich das Brustgewebe teilen. Ein Viertel der ovx und sham Mäuse bekommen garnichts und am letzten Tag RANKL. Wenn die Teilung von Brustgewebe RANKL-abhängig ist, sollte sich bei diesen es genauso teilen wie bei den anderen. ABer das werden wir sehen...


21.7. : Der Tag begann mit einem Lab-meeting, diesmal war Greg dran. Diesmal ging es mit dem Verständnis schon um einiges besser :)
Verena hat den Überstand aus der Zellkultur entnommen, um mit ihm einen ELISA Test durchzuführen. Was das ist erkläre ich wieder in den Methoden :) der Überstand wird eingefroren um ihn morgen verwenden zu können. DIe Zellen, die sich am Boden abgesetzt haben werden weggeworfen, für den Test braucht man nur den Überstand. In diesem sind nämlich die Proteine, die die Zellen erzeugen, die mit dem ELISA Test gemessen werden.
Ich habe in der Histologie die Organe der MPA-Tumor-Mäuse die getötet werden mussten in Paraffin eingebettet.
Dann ging es wieder ins MouseHouse: vorher noch oben schnell das Anästethikum vorbereitet, Verena hat das Östrogen und das Vehicle vorbereitet, die Substanz in dem das Östrogen gelöst ist, nur ohne Östrogen, praktisch ein Placebo.
Dann unten im MouseHouse musste ich die Mäuse anästhesieren, was garnicht so einfach war, da sie sich ziemlich wehrten, aber wenigstens hab ich diesmal keinen Krampf bekommen und Verena verpasste ihnen das passende Mittel.
Danach kontrollierten wir noch die Käfige und trennten die Mäuse, dann waren wir fertig.


22.7. : Gleich in der Früh begannen wir mit dem ELISA-Test.

Jetzt werde ich einmal auch unter diesem Titel posten:

Natürlich hat man in einem Labor vielerlei Aufgaben. Was ich so tue poste ich ja regelmäßig, jedoch habe ich eben heute und gestern Aufgabengebiete zugeteilt bekommen die ich alleine mache:

1. PCRs: geht schon super, nur die Auswertung mache ich noch mit Verena gemeinsam, denn wenn da ein Fehler passiert ist das schlecht ;)
2. Mäuse nummerieren/Gewebeproben nehmen: kann ich auch selbstständig, jedoch ist dieser spezielle Griff, mit dem man die Mäuse nehmen muss bei meinen Black6-Freunden immer wieder eine challenge...

Heute hab ich mal wieder etwas Zeit darum schreibe ich früher:

Nach dem Frühstück haben wir die mittlerweile aufbereiteten Gewebeproben mit Wasser verdünnt, damit sie fertig sind für die PCR. Diese durchzuführen (eine cre-PCR) war meine Aufgabe. Rubina hat mir auch 12 Proben gegeben, die ich auch gleich mal vorbereitet habe. PCRs sind jetzt schon beinahe Routine, fragen brauche ich fast nichtmehr (außer ich finde etwas nicht ;) ).
PCRs fertig vorbereitet, in die Maschine, großes Gel für meine Proben und kleines für Rubinas gemacht und fertig. Jetzt heißts wieder warten..

Unsere PCR hat gut funktioniert, Rubinas leider nicht so gut.. Aber naja das kann bei einer PCR nunmal vorkommen. Jz erklärte mir Verena das Programm für den restlichen Tag: Wir mischten eine Bakteriennährlösung zusammen, einen sogennanten Brewer, um diesen dann Mäusen in den Buachraum zu injizieren. Es wird eine Entzündung ausgelöst und wir können dann bestimmte Zellen, die Macrophagen (weiße Blutzellen), entnehmen. Warum wir das machen wollen? cblb/MyD88 KO Mäuse haben sehr schlimme Lungenentzündungen, die auch ein Grund für ihr frühes Versterben sind. Das sonderbare daran ist, dass sie in ihren Lungen ungewöhnlich viele Macrophagen haben. Wir wollen jetzt untersuchen, ob die Macrophagen in singleKOs schon gestört sind.
Im MouseHouse angekommen haben wir nach den Daten der PCR wieder Mäuse sortiert und breeding pairs erstellt und dann unsere Testmäuse bestimmt: ein Paar cblb -/-, ein Paar MyD88 -/- und ein Paar normale BalbC Mäuse als Referenz. Sie wurden wieder von mir anästhesiert und Verena hat ihnen den Brewer injeziert. Nach 4 Tagen können wir die Macrophagen dann entnehmen.

Nachdem war meine Arbeit getan und ich ging in ein verfrühtes Wochenende ;)

Heute wieder was Interessantes gelernt:

Wie aus DNA Proteine werden hab ich ja schonmal gebloggt.. Dieses "Verfahren" hat jetzt einige Stufen dazu bekommen:
Die DNA besteht aus Exons und Introns. DNA wird durch Polymerase transkripiert in pre-mRNA. Diese ist einsträngig und hat auch Exons, welche als eigentliche Vorlage für das Protein dienen und Introns, welche nur regulatorische Funktionen haben. Dann kommt ein sogennates splicosom und schneidet die Entrons hinaus. Das splicosom erkennt die zu splicende Stelle am splice-acceptor der aus den Basen GU besteht und dem splice-donor aus AG.
Ist das Intron entfernt wird aus den verbleibenden Exons mature-mRNA, praktisch die fertige. Diese wird dann translitiert und zu einem Protein.

alternatives Splicing: Die mature mRNA kann aus verschiedenen Exons bestehen. Nehmen wir an, ein Gen hat 6 Exons, kann die mRNA aus Exon 1,3,4,5,6 oder aus 2 und 5 bestehen. Dadurch entstehen verschiedene Arten von Genen. Diese äußern sich in verschiedener Lage im Organismus oder unterscheiden sich in der Funktion. Jedoch können Exons nicht beliebig zusammengesetzt werden, die Anzahl und welche Exons zusammengestzt werden können ist festgelegt.

Heute schreibe ich schon während der Arbeit einen Teil, Verena sucht sich gerade Informationen aus dem Internet zusammen.

Heute musste ich ein bisschen früher kommen als sonst, weil heute Lab Meeting war. Das kommt in regelmäßigen Abständen vor, alle "Laborangehörige" versammeln sich in einem Raum und immer zwei Leute müssen via Powerpoint präsentieren wie weit sie mit ihren Projekten sind. Und das auf Englisch.. Also dem ganzen wäre auch schon auf Deutsch schwer zu folgen, und dann auch noch auf Englisch... Naja viel hab ich nicht verstanden aber doch einiges. :)

Dann hat mir Verena gesagt ich soll die cblb PCR wiederholen. Dadurch das ich das jetzt schon öfters gemacht habe ging es recht schnell und ich machte es ganz alleine. :) Ja dann das ganze in die PCR Maschine. Das Gel ging naturlich auch recht schnell und jetzt heißt es erstmal abwarten.

Nach dem Essen werteten wir die PCR aus. Es hatte zumindest drei viertel gepasst, das war schon was. Aufgrund unserer Daten stellten wir wieder breeding pairs zusammen, wir wollen ja cblb -/- MyD88 -/- Mäuse haben.
Mit dem Block gings dann hinunter ins MouseHouse.

Nach der Umkleideprozedur und dem Ganzkörperfön sortierten wir wieder Käfige und stellten die breeding pairs zusammen. Danach kamen die mittlerweile jugendlichen 3 Wochen alten Mäuse von den Eltern weg. Sie wurden erstmal nach Geschlecht getrennt und bekamen dann Extra-Käfige. Dann mussten wir wieder die Ohren klipsen um ihnen eine Nummer zu geben, als auch Gewebe für die PCR zu bekommen. Und genau das war mein Problem: Black6 Mäuse sind unruhig und aggressiv.. Ist sicher keine angenehme Prozedur das Ohrenzwicken, aber ist gleich vorbei und die BALBc stellen sich auch nicht so an.. Jedenfalls wurde ich dann fast gebissen, ein paar weitere habens probiert, aber ich war schneller. Dann nach der achten Maus bekam ich langsam einen Krampf im Daumen vom Mäuse halten, und das sie dann noch immer herumzappelten, sodass das mit dem klipsen doppelt so lang dauerte machte es nicht besser.. Aber schließlich waren wir dann doch fertig, umgezogen und ich durfte nach Hause.

P.S.: Fast vergessen zu posten: den operierten Mäusen geht es blendend :D Erfolgserlebnis!

Zum heutigen Tag:

Ovarektomie: Entfernung der Eierstöcke oder Teile davon; wird gemacht, um zu verhindern, das die Maus das Hormon Östrogen selbstständig bildet

sham: sham-Operation heißt das man zwar anästhesiert und aufschneidet, jedoch den eigentlichen Eingrif nicht durchführt und einfach wieder zunäht. Wird gemacht um eine Kontrollgruppe für Experimente für die anderen nicht-sham-operierten Mäuse zu haben, mit dem Ziel zu zeigen, das bestimmte Ergebnisse auf das Experiment zurückgehen, und nicht auf die Operation selbst

Mein Tag heute am IMBA war zwar recht einseitig, jedoch nicht unspannend. Auf uns warteten 20 BALB/c-Wildtyp-Mäuse die operiert werden mussten. Natürlich freute ich mich schon auf die Erfahrung :) .

Zuerst stärkten wir uns noch beim Frühstück, dann gings schon ab ins Labor um das Anästhetikum für die Mäuse zu mischen.
Dann noch das Besteck für die Eingriffe zusammengesucht, kleine Insulinspritzen mit kurzer Nadel für die Anästhesie und schon gings runter ins MouseHouse.
Wieder die gewohnte Umkleideprozedur (ich fand diesmal sogar einen XXL-Overall der mir passte :D ) gleich zum Raum indem wir die Mäuse operieren würden.
Verena klärte mich auf: Ovarektomie, also Entfernung der Eierstöcke bei der einen Hälfte, die andere wird sham-operiert (-> Methoden). Ich durfte die Mäuse mal betäuben, also wie ich es schonmal beim Klipsen der Ohren gemacht habe, am Fell im Genick genommen und den Schwanz zwischen den Fingern eigeklemmt. Ein kleiner Piks in den Bauch und die Sache war erledigt. Ging eigentlich richtig gut. Einige Mäuse fetzten herum und sprangen die ganze Zeit, was echt arg aussah, aber Verena meinte das das bei BALB/c-Mäusen öfters vorkommt.

Dann kam die eigentliche Operation, welche Verena gekonnt ausführte, ich sah erstmal zu und machte Fotos. Zuerst wird das Fell auf einer Flanke der Maus ca 5mm weit aaufgeschnitten. Dann sieht man das Peritoneum, das ist die "Bauchwand", Muskeln, die die unteren Organe einschließen. Auch dieses wird aufgeschnitten und man hat freie Sicht ins Innere (aber nur einen kleinen Ausschnitt). Wenn man die Schnitte gut gesetzt hat, fährt man mit einer Pinzette ein wenig hinein und das Erste was man herausziehen kann ist schon der Eierstock mit Eileiter und einer Menge Fettgewebe dran. Das wird geklemmt damit es draußen bleibt, eine Naht knapp unter dem Eierstock der Eileiter abgebunden (was ich auch einmal machen durfte :) ) und dann der Eierstock inklusive Fettgewebe entfernt. Die Naht bleibt am Eierstock und das ganze wird ins Peritoneum zurück"gestopft". Dann wird das Peritoneum zusammengenäht, ein Stiich mit Doppelknoten reciht und das gleiche mit dem Fell auch noch. Dann ist eine Seite fertig, und die Andere kommt dran.
Ich passte auf die schlafenden Mäuse auf, damit sie nicht auskühlten, ihr Kreislauf ist ja ganz unten durch die Narkose. Aber mit der Wärmelampe die wir aufgestellt hatten war das kein Problem. Ich versorgte die Mäuse, richtete Käfige her und nach 8 Mäusen waren schon mehr als 3 Stunden vergangen. Da hatten wir uns die Mittagspause verdient :) .

Wir besorgten uns vor der Rückkehr noch zusätzliche Nadel und Faden zum Nähen und Klipser für die Ohren zum Markieren. Unten waren die Mäuse schon wieder aufgewcht, jedoch stand noch eine Ovarektomie für 2 Mäuse an, die anderen durfte ich sham operieren :). Das war schon ein ziemlich cooles Gefühl und ich stellte mich, denke ich mal, garnicht schlecht an :) trotzdem musste mir Verena grad am Anfang beim Nähen noch etwas helfen, da der Knoten mit Pinzetten etwas fummelig ist.. Aber schließlich waren wir doch noch fertig geworden und ich habe erfolgreich Mäuse operiert :) voll super :D

Unsere Patienten brachten wir in unseren Raum zurück, füllten ein Experimentblatt und Käfigkärtchen aus und stellten die Mäuse zurück ins Rack. Eine kleine Überraschung zum Schluss: ein breeding pair, bei dem erst vor einer Woche neuer Nachwuchs geboren wurde, hat das zweite Weibchen auch Junge bekommen. Gleich 12 Stück! Noch rosa und sehen aus wie Minialiens, aber bald sehen sie aus wie Mäuse ;) danach noch umgezogen, und ich konnte Heim...

So, heute doch einiges gelernt:

qPCR, qRTPCR: in dieser wird ein bestimmter Genabschnitt so vervielfacht, dass die Anzahl exponential ansteigt. Durch einen fluoreszierenden Farbstoff wird es dann sichtbar. Das wird durch den Computer auf einer Kurve dargestellt. Es wird eine Referenzkurve von einem Gen (in diesem Fall Actin) bei dem die Probe bei einem bestimmten Wert steigt. Die anderen Proben werden dann mit dieser in Differenz gesetzt, dadurch hält man das Verhältnis. eine qPCR ohne Rechnung liefert nur Verhältnisse! Zahlen (in Form von x-mal öfter als ... enthalten) lassen sich in Excel berechnen.

SYBR-green-Mix: ist ein MIX aus dNTPs, Polymerase, Puffer und eben dem benötigten Fluoreszenzfarbstoff (in diesem Fall grün).

cyclinD1: ist ein Indikator dafür, ob die Zelle im Zellzyklus ist und sich teilt; bei Krebs fallen viele Zellteilungen an; bei RANK ist es aktiviert, cyclinD1 ist bei der Brustdrüsenentwicklung avtiv

Toll-like Receptor Signaling: es gibt 9 verschiedene toll-like rezeptoren. Nur für 2 ist MyD88 nicht unbedingt erforderlich. Die Rezeptoren erkennen Pathogene wie Viren, Bakterien etc. Sie lösen Kettenreaktionen aus, um dann verschiedene Reaktionen im Immunsystem und im Genom zu aktivieren, um diese Pathogene zu deaktivieren.

Ich hatte mit einem gemütlichen Frühstück einen tollen Start in die Arbeitswoche: trotzdem rief die Arbeit.

Als Erstes bereiteten Verena und ich eine qPCR (auch qRTPCR) vor. Wir testeten MPA-Tumore, welche durch Progesteron verursacht werden, und NeuT-Tumore, welche durch ein mutiertes Oncogen verursacht werden. Das mutierte Oncogen verursacht extreme Zellvermehrung.
Getestet wurden die Tumore auf RANK, RANKL, Progesteron receptor (RANKL wird durch Progesteron aktiviert), cyclinD1 (genauer beschrieben in den Methoden) und Actin (ist wichtig für das Zytoskelett und immer aktiv) als Referenz.
Es wurden wieder Mastermixe erstellt, nur diesmal genauer, da bei einer qPCR wesentlich genauer sein muss als bei einer normalen PCR. In den Mastermix kamen die passenden Primer, Wasser und SYBRgreen-Mix (-> Methoden).
Das ganze wurde dann in PCR-Platten pipettiert und dann in die qPCR-Maschinen gestellt. Auf einem verbundenen Computer wird ein Programm eingegeben und die Proben beschriftet. Die qPCR dauert mehrere Stunden. Das Ergebnis wird dann am Computer angezeigt.

Währenddessen bereitete ich ein (Elektrophorese)Gel vor, auf das die qPCR-Proben aufgetragen werden sollen. Magda teilte uns mit das die cblb Proben unserer letzten PCR falsch waren, und wir sie nochmal machen müssen, deshalb stand das Nachmittagsprogramm schon fest.

Nach dem Essen begann ich mit der Vorbereitung für die cblb-PCR. Das ging mittlerweile recht schnell. Wir stellten die PCR ins Gerät und machten uns auf zur qPCR.
Auf dem Computerbildschirm sahen wir dann die Kurven der qPCR. Eine probe hatte nicht funktioniert, aber das war nicht schlimm, da das an den Primern lag und wir die gleiche probe noch mit anderen Primern gemacht hatten. Froh über das Ergebnis wurden die Dateien noch in Excel gespeichert und meine qPCR-Kurven ausgedruckt.
Verena gab die Daten der qPCR in eine Excel Tabelle ein, um sie später vergleichen zu können und Schlüsse zu ziehen. ich ahbe das mitverfolgt, nur nach den ganzen Formeln und Verlinkungen bin ich bald ausgestiegen..
Aber das machte nichts, meine PCR war nämlich fertig. PCR und qPCR wurden nach allen Regeln der Kunst auf das Gel aufgetragen und die Elektrophorese gestartet.

Dann kam noch eine Theoriestunde und die ePhorese war schon fertig. Die qPCR konnte gut ausgewertet werden, doch leider ist bei der PCR etwas scheif gegangen und es war umsonst.. das ärgerte mich zwar aber Verena sagte das macht nichts und das das bei cblb oft vorkommt. Dann wurde mir noch mitgeteilt das wir morgen Mäuse operieren würden, und das 6 Stunden lang, und dann wurde ich entlassen. Bin gespannt was mich morgen erwartet.. ;)