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Zu den letzten Methoden:

Macrophagen in Zellkultur: Zuerst muss das Nährmedium her, auf dem die Zellen gehalten werden sollen. Dieses wird speziell gemischt und in Schalen oder Platten mit kleinen Kammern zu den Zellen gefüllt. Das ganze muss natürlich möglichst steril passieren. Im Zellkulturraum gibt es dazu zwei "Abzugshauben" die mit einem Fenster verschlossen werden können. Es ist sogar ein UV-Reinigungsgerät eingebaut um es richtig steril zu halten. Das ganze muss dann auch noch auf ca 37° (Körpertemperatur) gehalten werden und man kann experimente mit den Zellen machen.

ELISA-Test: (muss noch nachgetragen werden)

So, ich habe jetzt einiges zu posten:

20.7. : Verena hat die entnommenen Macrophagen mit verschiedenen Reizen stimuliert, wie zum Beispiel LPS (Verbindungen von Fetten und Zuckern die in der äußeren Membran von Bakterien vorhanden sind; sind Erkennungsmerkmal für Immunsystem) um zu sehen, ob sich die Macrophagen normal verhalten, oder in irgendeiner Weise überreagieren. Nachdem wurden die Macrophagen wieder in Ruhe gelassen.
Weiters wurden den ovarektumierten (ab jetzt ovx) Mäusen und den sham Mäusen zur Hälfte ein MPA Pellet und zur Hälfte garnichts implantiert. Die Hälfte der MPA Mäuse bekamen zusätzlich noch Östrogen. Sie werden über drei Tage behandelt. Nach den drei Tagen werden ihnen die Brüste entnommen und Schnitte angefertigt um zu sehen, ob es an RANKL liegt, dass sich das Brustgewebe teilt.
ovx Mäuse können von selbst kein Östrogen erzeugen, da Östrogen in den Eierstöcken produziert wird. Beide, ovx und sham Mäuse werden gleich behandelt. RANKL braucht Östrogen und MPA um induziert zu werden. Also nur in denen, in denen beides vorhanden ist, und somit auch RANKL sollte sich das Brustgewebe teilen. Ein Viertel der ovx und sham Mäuse bekommen garnichts und am letzten Tag RANKL. Wenn die Teilung von Brustgewebe RANKL-abhängig ist, sollte sich bei diesen es genauso teilen wie bei den anderen. ABer das werden wir sehen...


21.7. : Der Tag begann mit einem Lab-meeting, diesmal war Greg dran. Diesmal ging es mit dem Verständnis schon um einiges besser :)
Verena hat den Überstand aus der Zellkultur entnommen, um mit ihm einen ELISA Test durchzuführen. Was das ist erkläre ich wieder in den Methoden :) der Überstand wird eingefroren um ihn morgen verwenden zu können. DIe Zellen, die sich am Boden abgesetzt haben werden weggeworfen, für den Test braucht man nur den Überstand. In diesem sind nämlich die Proteine, die die Zellen erzeugen, die mit dem ELISA Test gemessen werden.
Ich habe in der Histologie die Organe der MPA-Tumor-Mäuse die getötet werden mussten in Paraffin eingebettet.
Dann ging es wieder ins MouseHouse: vorher noch oben schnell das Anästethikum vorbereitet, Verena hat das Östrogen und das Vehicle vorbereitet, die Substanz in dem das Östrogen gelöst ist, nur ohne Östrogen, praktisch ein Placebo.
Dann unten im MouseHouse musste ich die Mäuse anästhesieren, was garnicht so einfach war, da sie sich ziemlich wehrten, aber wenigstens hab ich diesmal keinen Krampf bekommen und Verena verpasste ihnen das passende Mittel.
Danach kontrollierten wir noch die Käfige und trennten die Mäuse, dann waren wir fertig.


22.7. : Gleich in der Früh begannen wir mit dem ELISA-Test.

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Jetzt werde ich einmal auch unter diesem Titel posten:

Natürlich hat man in einem Labor vielerlei Aufgaben. Was ich so tue poste ich ja regelmäßig, jedoch habe ich eben heute und gestern Aufgabengebiete zugeteilt bekommen die ich alleine mache:

1. PCRs: geht schon super, nur die Auswertung mache ich noch mit Verena gemeinsam, denn wenn da ein Fehler passiert ist das schlecht ;)
2. Mäuse nummerieren/Gewebeproben nehmen: kann ich auch selbstständig, jedoch ist dieser spezielle Griff, mit dem man die Mäuse nehmen muss bei meinen Black6-Freunden immer wieder eine challenge...

Heute hab ich mal wieder etwas Zeit darum schreibe ich früher:

Nach dem Frühstück haben wir die mittlerweile aufbereiteten Gewebeproben mit Wasser verdünnt, damit sie fertig sind für die PCR. Diese durchzuführen (eine cre-PCR) war meine Aufgabe. Rubina hat mir auch 12 Proben gegeben, die ich auch gleich mal vorbereitet habe. PCRs sind jetzt schon beinahe Routine, fragen brauche ich fast nichtmehr (außer ich finde etwas nicht ;) ).
PCRs fertig vorbereitet, in die Maschine, großes Gel für meine Proben und kleines für Rubinas gemacht und fertig. Jetzt heißts wieder warten..

Unsere PCR hat gut funktioniert, Rubinas leider nicht so gut.. Aber naja das kann bei einer PCR nunmal vorkommen. Jz erklärte mir Verena das Programm für den restlichen Tag: Wir mischten eine Bakteriennährlösung zusammen, einen sogennanten Brewer, um diesen dann Mäusen in den Buachraum zu injizieren. Es wird eine Entzündung ausgelöst und wir können dann bestimmte Zellen, die Macrophagen (weiße Blutzellen), entnehmen. Warum wir das machen wollen? cblb/MyD88 KO Mäuse haben sehr schlimme Lungenentzündungen, die auch ein Grund für ihr frühes Versterben sind. Das sonderbare daran ist, dass sie in ihren Lungen ungewöhnlich viele Macrophagen haben. Wir wollen jetzt untersuchen, ob die Macrophagen in singleKOs schon gestört sind.
Im MouseHouse angekommen haben wir nach den Daten der PCR wieder Mäuse sortiert und breeding pairs erstellt und dann unsere Testmäuse bestimmt: ein Paar cblb -/-, ein Paar MyD88 -/- und ein Paar normale BalbC Mäuse als Referenz. Sie wurden wieder von mir anästhesiert und Verena hat ihnen den Brewer injeziert. Nach 4 Tagen können wir die Macrophagen dann entnehmen.

Nachdem war meine Arbeit getan und ich ging in ein verfrühtes Wochenende ;)

Heute wieder was Interessantes gelernt:

Wie aus DNA Proteine werden hab ich ja schonmal gebloggt.. Dieses "Verfahren" hat jetzt einige Stufen dazu bekommen:
Die DNA besteht aus Exons und Introns. DNA wird durch Polymerase transkripiert in pre-mRNA. Diese ist einsträngig und hat auch Exons, welche als eigentliche Vorlage für das Protein dienen und Introns, welche nur regulatorische Funktionen haben. Dann kommt ein sogennates splicosom und schneidet die Entrons hinaus. Das splicosom erkennt die zu splicende Stelle am splice-acceptor der aus den Basen GU besteht und dem splice-donor aus AG.
Ist das Intron entfernt wird aus den verbleibenden Exons mature-mRNA, praktisch die fertige. Diese wird dann translitiert und zu einem Protein.

alternatives Splicing: Die mature mRNA kann aus verschiedenen Exons bestehen. Nehmen wir an, ein Gen hat 6 Exons, kann die mRNA aus Exon 1,3,4,5,6 oder aus 2 und 5 bestehen. Dadurch entstehen verschiedene Arten von Genen. Diese äußern sich in verschiedener Lage im Organismus oder unterscheiden sich in der Funktion. Jedoch können Exons nicht beliebig zusammengesetzt werden, die Anzahl und welche Exons zusammengestzt werden können ist festgelegt.