5g Pepton
5g NaCl
2,5g Yeast
1l Wasser

Das Gemisch wird dann autoklaviert und nachdem es abgekühlt ist wird ein Antibiotikum hinzu gegeben.
Anschließend wird die Flüssigkeit auf Petrischalen aufgeteilt.

Heute durfte ich den "Tierstall" besuchen. Er ist im Keller der Biochemie an der KF. Hier wird geprüft ob ein Gen, Enzym oder Protein vom Körper aufgenommen wird oder abgestoßen wird, ob es schädlich ist und welchen Einfluss es auf den Körper hat. Auch Antikörper zum Beispiel für einen Westernblot werden hier "hergestellt". Dieser Bereich untersteht sehr strengen Hygienebestimmungen, sodass keine Verunreinigungen oder Keime mit in diesen Bereich getragen werden können. Einen solchen "Tierstall" gibt es auch an der Med.-Uni.

Nach dem wir am Vormittag eine PCR gemacht haben, sind wir am Nachmittag zum Institut für Biochemie an der KF. Dort haben wir Bakterien angesehen, die durch eine Antikörperreaktion zum Leuchten begonnen haben.
Der Mechanismus ist dabei der gleiche wie der beim Westernblot: ein primär Antikörper bindet an einem Protein und der sekundär Antikörper am primären, dabei entsteht eine Lumineszens. In diesem Fall kann man die leuchtenden Bakterien unter einem speziellen Mikroskop ansehen.

Nach dem wir am Vormittag wieder einen Westernblot gemacht haben, mit anschließendem Kammertransfer, haben wir einen kleinen Rundgang an den chemischen Instituten der TU bekommen. Wir haben am Institut für organische Chemie zum Beispiel ein HPLC-Gerät gesehen (high performance liquid chromatography) und erfuhren etwas über die verschiedenen Forschungsgebiete.
Danach gingen wir rüber in das Institut für anorganische Chemie. auch hier erhielten wir eine kleine Führung. Das war schon ein großer Kontrast zu unserer Forschung, vor allem da dieses Institut nicht mit Bakterien zu tun hat.

"Hier tragen sie die Handschuhe nicht um ihre Proben vor Verschmutzung zu schützen, sondern um sich selbst vor den Proben zu schützen."

Heute haben wir in der Zellkultur ausgeholfen. Wir haben einen Mediumswechsel durchgeführt, Zellen gezählt und RNA geerntet.

Primerstock:
Abhd 15 - Sig Pep Bgl 2 fw
Abhd 15 -Xho 1rev
Wasser

Wasser
Puffer HF
dNTP
Primerstock
Template DNA
DMSO
Phusion RNA

Siehe PCR - Kontrollgel

SDS-Gel
Puffer(+DTE+LDS)

Das Gel wird in die Kammer gestellt. Die Kammer wird dann mit dem Puffer befüllt und das Gel wird für 1h bei 175V laufen gelassen.

Die Banden werden dann auf eine Membran transferiert, in dem man die Membran auf das Gel legt und den Strom normal zur Oberfläche fließen lässt.

Die Membran wird zusammen mit dem primärAntikörper eingeschweißt und über Nacht gewendet. Die Membran wird dann mehrmals mit PBST gewaschen und anschließend entwicklt.

Das Entwickeln erfolgt durch Zugabe des sekundär Antikörpers. Diese beginnen zu reagieren. Bei dieser Reaktion wird unter anderem Licht frei, das mit einem Stück Photofilm aufgefangen werden und entwickelt werden kann.

6 Eppis
Beschriftung:
0; 2,5; 5; 10; 15; 20;
In die von 0-15 kommt 25µl NaCl-Puffer In das mit 20 kommen 50µl des Stocks von dem dann 25µl in das mit 10 von dem dann wieder 25µl in das mit 5 und dann noch einmal in das mit 2,5.
In das mit 15 kommen 6,25µl Stock und 18,75µl NaCl-Puffer

Der Inhalt der Eppis wird dann als Standartreihe aufgetragen und dann mit der Probe Verglichen.

5ml Medium in ein Falkon
Zellen von Agarplatte abkratzen
in Medium

1,2g Agarose
120ml TAE 1% Puffer

Die Lösung wird erhitzt und geschüttelt.
Wenn die Lösung Handwarm ist wird ein Tropfen Ethidiumbromid hinzu gegeben (Ein Farbstoff, der sich in DNA einlagert und unter UV-Einstrahlung zum Leuchten beginnt).
Dann wird Das Gemisch in eine Form gegossen, mit einem Kamm versehen und dann stehen gelassen, bis die Lösung sich zu Gel verdickt hat.
Danach können die Proben aufgetragen waerden.
Danach wird das Gel in eine Kammer gelegt, das mit demselben Puffer ausgefüllt ist und Spannung angelegt.

Die PCR ist eine Methode zur vervielfältigung eines Gesnes mit Hilfe eines Mastermixes, der aus Primern, Puffer, einem Salz und der Polymerase des Puffers besteht.

Für die PCR gibt es einen eigens dafür gebauten Heizblock, mit verschiedenen Programme, mit denen man die Vervielfältigung steuern kann. DAbei gibt es immer Drei Phasen, die belibig oft laufen können. Aufspalten-"Healing"-Pause für die Zellen. Bei diesen 3 Phasen können die Temperatur je nach Primer und Gen variieren kann.

Anschließend wird mit einem Teil der Gene ein Einzelausstrich gemacht, ´mit dem man dann durch ein Agarose-Gel nachweisen kann, dass das besagte Gen von den Zellen aufgenommen wurde.

Heute haben wir den Westernblot, den wir gestern schon begonnen haben, in eine neue Milch-Lösung gegeben und ihn dann eingeschweißt. Danach wurder er für ca eine Stunde gedreht. Nach dieser Stunde haben wir ihn dann wieder aus dem Plastik heraus geschnitten und ihn 3 mal für 10min gewaschen und anschließend entwickelt.
Die Banden am Photopapier sind leider so verschwommen gewesen, dass man keine einzelnen Banden mehr erkennen konnte. Das kann daran gelegen haben, dass zuviel Licht vom Westernblot abgestrahlt wurde, es kann aber auch an dem neuen Gel gelegen haben, das wir ausprobiert haben.

10x Puffer auf 1x Puffer verdünnen(19ml 10xPuffer+171ml Wasser)

90ml in beide Tanks der Elektrophoresekammer füllen
Gel einlegen
12min leer laufen lassen


Proben+8µl NuPage(Farbstoff)+ 1µl DTE
dann auf 35µl auffüllen
Standart: 5µl NuPage + 1µl DTE +10µl Seablue Standart

Die Proben und der Standart wird dann auf das Gel aufgetragen und für 1,75h laufen lassen.


Danach muss man dann díe Banden auf das Gel übertragen. Dazu benutzt man einen Tris-Chlor-Methanol-Puffer.

Einwiegen
25mM Tris
192mM Glycin
0,1% SDS
mit Wasser auffüllen auf etwas weniger als 100ml

Tris:
(0,025mol*121,14g/mol*100ml)/1000ml=0,303g
d.h.: 0,303g einwiegen

Glycin:
(0,192mol*72,07g/mol*100ml)/1000ml=1,44g
d.h.: 1,44g einwiegen

+1ml SDS

pH Wert mit HCl auf 8,3 einstellen
auf 100ml auffüllen