Vor ein paar Monaten wurde ich sozusagen "zwangsbeglückt" mit der Zuteilung eines Summerschool-Schülers. Allerdings stellte sich gleich nach den ersten paar Tagen heraus, daß ich mit Georg das beste Los gezogen habe. Er hat sich sehr schnell in unserer Abteilung (Biozentrum Innsbruck, Sektion für Genomik und RNomik) eingelebt und stellte sich als äußerst wissbegieriger Jungwisschenschaftler heraus. Er hat eine schnelle Auffassungsgabe und führte alle Versuche, die ich ihm anvertraut habe, gewissenhaft durch.

Ich hoffe ich habe Georg den Laboralltag näher gebracht und daß er auch etwas Spaß bei uns hatte. Ich wünsche ihm alles Gute für sein Studium in München!

Heute war mein letzter Tag auf der Sektion für Genomik und RNomik der Innsbrucker Uni. Ich kann es kaum glauben wie schnell die Zeit vergangen ist, aber wenn ich meine Einträge von vor knapp drei Wochen lese merke ich auch, wie viel ich in dieser doch relativ kurzen Zeit dazu gelernt habe. Die Arbeit war sehr interessant sowie erstaunlich vielfältig: Bakterienkulturen züchten, Arbeit im Zellkulturlabor , Arbeit im Radioaktiv-Labor, PCRs, Sequencierungen etc. etc. Außerdem hätte ich mir nicht gedacht, dass ich so viele Sachen selbst machen darf (wobei ich allerdings, abgesehen von ein, zwei besonders glitschigen Agarose-Gelen, auch relativ wenig ruiniert habe :)…) und sogar ganz eigenständig an einem Projekt (Mikrowellen-Verdau) arbeiten darf.
Alles in allem hat mir mein Praktikum also sehr gut gefallen, und ich würde es jederzeit wiederholen.
Abschließend möchte ich mich noch einmal bei meinen Betreuern Melanie Lukasser und Andreas Ploner, sowie der restlichen Abteilung und allen anderen, die ich in den letzten Wochen mit meinen Fragen gelöchert (und vielleicht auch manchmal genervt) habe, herzlich bedanken.

Um zu überprüfen, ob das Transfizieren der Zellen gestern funktioniert hat, haben wir sie uns heute unter einer Floureszenzlampe angesehen: Die Zellen, die die DNA aufgenommen und expremiert(d.h. in RNA umgeschrieben) haben leuchten grün, was bei allen Proben bei einem guten Teil der Zellen der Fall war. Wir haben dann auf alle Kulturen nochmals 4 ml Medium pipettiert (gestern haben wir nur wenig Medium auf die Zellen pipettiert, damit die Wahrscheinlichkeit einer DNA-Aufnahme größer ist).

Außerdem haben wir nochmals eine PCR mit drei Hammerhead-Konstrukten durchgeführt (erst heute, da die Primer erst heute gekommen sind).

Weiters habe ich die grundlegende Struktur meiner Forschungsdokumentation geplant.

Am Morgen haben wir den Phosphor Imager (= eine Art wieder verwendbarer Film, der durch die radioaktive Strahlung belichtet wird), den wir gestern auf das Polyacrylamid-Gel mit der, mit Hammerhead geschnittenen, radioaktiven RNA gelegt haben, entwickelt. Die Banden sind zwar etwas verschmiert (vielleicht zu viel Radioaktivität, oder die RNA ist bereits teilweise zerfallen), es ist aber trotzdem relativ gut zu erkennen, dass Hammerhead wie gewollt geschnitten hat. Im nächsten Schritt haben wir heute eine Kultur von Hek Zellen transfiziert. D.h. wir haben die DNA, die zur Hammerhead RNA wird, sowie DNA der zu schneidenden RNA in die Zelle eingebracht, um zu testen, ob die Reaktion auch in der Zelle funktioniert, also in der Umgebung in der sie dann später eingesetzt werden soll, um eine snoRNA zu zerstören (Genaueres siehe Tag 9). Das Zellgenom selbst spielt hier keine Rolle. Durch diese Reaktion soll nur getestet werden ob das Ganze auch unter den Bedingungen die in der Zelle herrschen funktioniert.
Am Nachmittag habe ich meine Mikrowellen Versuchsreihe fortgesetzt. Durch die vorigen Reaktionen habe ich ja bereits festgestellt, bei welcher Wattzahl und welcher Zeit es am besten funktioniert (2 mal 40 Sekunden bei 600W). Heute habe ich die Wartezeiten zwischen den beiden Mikrowellendurchgängen und vor der Zugabe der Dye variiert: bei Raumtemperatur, auf Eis und bei -20° mit Zeiten im Bereich von 2 bis 10 Minuten.
Die Ergebnisse werte ich dann morgen aus.

Gestern haben wir nochmals mit einer größeren Menge an Templates (die uns nach der Transkription Hammerhead RNA ergeben) eine PCR durchgeführt und das PCR-Produkt aufgereinigt, um nicht verbrauchte dNTPs und Primer loszuwerden. Mit der Transkription des zu schneidenden Plasmids haben wir auch gestern schon begonnen: Die Transkription beginnt bei dem T7 Insert, das am 5'-Ende des für uns interessanten Bereichs liegt, und setzt sich in 3'-Richtung fort. Das Enzym mit dem wir den Plasmid zuvor geschnitten haben wurde so gewählt, dass es am 3'-Ende des für uns interessanten Bereichs geschnitten hat. Transkripiert wird also nur der für uns interessante Bereich. Die Transkription wird mit radioaktiven NTPs durchgeführt (die Banden sind hier nach dem Schneiden und Auftragen aufs Gel besser zu erkennen als bei der Ethidiumbromid-Färbung, da nur die zu schneidende RNA radioaktiv ist, die schneidende Hammerhead RNA aber nicht. Bei der Ethidiumbromidfärbung machen die oft sehr starken Banden der Hammerhead RNA eine genaue Auswertung schwierig, bei der radioaktiven Methode besteht dieses Problem nicht.)

Heute mussten wir bei einigen Proben die PCR, die gestern leider teilweise nicht funktioniert hat, wiederholen. Nach dem Aufreinigen haben wir auch die PCR-Produkte transkripiert: zum Template werden NTPs, eine Transkriptase (in unserem Fall T7-RNA-Polymerase) und ein RNAse-Inhibitor (verhindert eine Zersetzung der RNA) zugegeben. Im Wasserbad bei 37° braucht die Transkription dann ca 3 bis 4 Stunden. Nach vollendeter Transkription wird die Transkriptase durch Erhitzen auf 95° inaktiviert.
Danach haben wir zu mehreren Proben der zu schneidenden RNA die verschiedenen Hammerheads hinzugefügt. Nach ca 90 Minuten haben wir dann mit dem Produkt eine Elektrophorese in Polyacrylamid durchgeführt. Die Ergebnisse werden morgen ausgewertet.

(Außerdem, traditionsgemäß, unsere Hek 293 A Kultur gesplittet.)

Heute (Fr. 8.9.) haben wir (also um das einmal klarzustellen: wir heißt meist ich und Melanie Lukasser, die hier als MTA arbeitet und mich betreut. (Danke Melanie!)) an dem Projekt eines hier arbeitenden Dissertanten (Andreas Ploner) mitgearbeitet. In diesem Projekt geht es im Grunde darum, die Funktion einer bestimmten snoRNA (=small nucleolar RNA), die nur im Gehirn vorkommt, zu klären. Dazu soll eine RNA (Hammerhead) verwendet werden, die andere RNAs schneiden kann und somit zerstört. Ursprünglich wurde sie in Viren entdeckt und jetzt versucht Andi sie so zu modifizieren, dass sie diese bestimmte snoRNA schneiden kann. Ist sie einmal zerstört, kann dann durch die Veränderungen in der Zelle vielleicht auf ihre Funktion geschlossen werden.
In diesem Zusammenhang haben wir heute mit dem Plasmid P3 (= ein Puc 19 Plasmid mit einem U81 insert (hier soll dann Hammerhead schneiden) und einem T7 Promotor (ist notwendig, für die Transkription)) einen Verdau mit EcoR 1 durchgeführt, um ihn zu linearisieren.
Während dem Verdau (den wir normal, bei 37° durchgeführt haben; der Mikrowellenverdau ist doch noch nicht so ausgereift) haben wir eine PCR mit den Hammerhead-Konstrukten (ein Plasmid, auf dem die DNA liegt, die uns nach der Transkription die Hammerhead RNA gibt) durchgeführt.

Nächste Woche werden wir dann das linearisierte Plasmid P3 transkripieren (zuerst mussten wir es linearisieren, um nach der Transkription einzelne RNA-Stücke und nicht eine ewig lange Wurst zu erhalten).
Ebenso werden wir die PCR-Produkte transkripieren und somit erhalten wir die Hammerhead RNA .
Das transkripirte Plasmid P3 schneiden wir dann mit verschiedenen, leicht veränderten Hammerheads. (Dieser Versuch dient nur dem Austesten, welches Hammerhead am besten funktioniert. Bei dem Plasmid P3 handelt es sich nur um ein Testobjekt.)