Und schon ist das Praktikum vorbei! In den drei Wochen habe ich viele Eindrücke aus dem Laboralltag sammeln können und einiges dazu gelernt. Ich bin jedenfalls sehr froh, dieses Praktikum gemacht zu haben, das ein oder andere gelernte werde ich sicher im Bio-Studium brauchen!

Was haben wir im Praktikum genau gemacht?
Wir haben uns mit dem hedgehog-pathway (Signaltransduktionsweg) beschäftigt. Tritt in diesem eine Fehlfunktion auf, ist dieser an der Krebsentstehung beteiligt.
Um mehr darüber zu erfahren, haben wir nach Transkriptionsfaktoren und -Partner gesucht.

Und schon hat die letzte Woche begonnen!
Heute gabs allerdings nicht so viel zu tun, da es heute einen Stromausfall hab der mehrere Stunden gedauert hat.
Danach haben wir noch eine Klonierung durchgeführt.
Genaueres folgt demnächst!

Ich war heute nur am Nachmittag im Labor da ich am Vormittag einen wichtigen Termin hatte. Julia hat mir dann davon berichtet dass sie die Plasmide aus den E.colus von gestern isoliert hat und eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt hat, um zu überprüfen ob diese das Insert in ihr Plasmid eingebaut haben. Anscheinend hat es funktioniert und ich freu mich natürlich mit.
Am Nachmittag haben wir noch o/n Kulturen von den Klonen der Backup-Platte angesetzt und angefangen ein Protokoll zu schreiben das ich soeben fertig gemacht habe (als Entschädigung dass Julia heute alleine war).

Wahnsinn, wie schnell die Zeit vergeht!

Gestern haben wir an den Membranen weitergearbeitet.
Wir haben zuerst die Flüssigkeiten aus den Schalchen abgeleert um sie anschließend jeweil 3 x 10 Minuten mit PBT zu waschen (auf der Schüttelplatte). Beim letzten Waschvorgang haben wir wir PBS verwendet. Danach haben wir sie wieder mit Antikörper angereichert und eine Stunde bei RT inkubieren lassen. An den Antikörpern ist ein Tag angebunden, der unter bestimmten Vorraussetzungen Licht emmittiert.
Anschließend haben wir die Membrane auf eine große Platte gegeben und dazu Stable Peroxide Solution und Luminol Enhancer Solution gegeben. Mit einer Pipette haben wir die Flüssigkeit angesaugt und immer wieder über die Membrane gespült. Diese Flüssigkeiten bewirken, dass die Banden später beim entwickeln auf einen FIlm farbig bzw. schwarz werden (an den Stellen wo Licht von antikörpern ausgesendet wird).
Nach dem Spülvorgang haben wir die Membrane in Zelofanfolie gepackt und einen Marker, der im Dunklen leuchetet, darauf geklebt. Das ganze haben wir dann in eine FIlmkasette gegeben und sind zur Dunkelkammer marschiert. Dort haben wir erstmal das gesamte Licht ausgemacht und zwei rote Lampen angedreht.
Wir habem einen Film genommen und diesen in die Filmkassette über die Membran gelegt. Nach ein paar Minuten haben wir ihn wieder herausgenommen.
Vorher haben wir uns schon drei Schalen mit Flüssigkeit hergerichtet:
In der ersten Schale befand sich die Entwickler-Flüssigkeit, in der zweiten der Fixierer und in der dritten Wasser zum spülen.
Wir haben den Film jeweils ein paar Minuten in die Flüssigkeiten gegeben und anschließend getrocknet. (Das Prinzip ist das gleiche wie beim Foto entwickeln!).
Am fertigen Film kann man dann ablesen, ob ein gewünschtes Protein exprimiert wird oder nicht.

Außerdem haben wir gestern noch (zum ersten mal) eine Transformation ganz alleine durchgeführt =)

Gestern haben wir mit einer Klonierung (von zwei Plasmiden) begonnen. Bei einer Klonierung wird eine DNA-Sequenz, die sich sonst nicht im Plasmid befindet, eingesetzt.
Zu Beginn haben wir Ansätze für die PCR angesetzt (PCR = PolymeraseChainReaction, dient zum vervielfätigen der DNA, in unserem Fall wollten wir das Insert, also den Teil der eingebaut werden soll, vervielfältigen).
Die vervielfältigte DNA haben wir dann auf ein Agarosegel aufgetragen. Nach der Elektrophorese haben wir die DNA-Banden aus dem Gel herausgeschnitten und in neue Eppis gegeben. Durch den hinzugefügten Capturepuffer schmilzt das Geld, wenn man die Eppis auf die Thermoplatte gibt. Nach dem Vortexen und inkubieren haben wir den Inhalt in Filtereppis umgefüllt. Nach kurzer Inkubationszeit haben wir diese zentrifugiert und anschließend einen Waschpuffer dazugegeben. Dann wurde erneut kurz zentrifugiert. Den Überstand haben wir abgeleert, da die DNA durch die Filter "gewandert" ist.
Dazu haben wir nun TE-Puffer gegeben und wieder die Proben inkubiert und zentrifugiert.
DIe Flüssigkeit unter dem Filter wird nochmal auf den Filter pipettiert und erneut zentrifugiert.

Dann wurde es Zeit die Restriktionsverdaue anzusetzen.
Wir haben zuerst mit ECORI und später mib XBAI verdaut.
(kein Doppelverdau, sondern hintereinander!)
Nach jedem Verdau haben wir die Proben wieder auf Agarosegel aufgetragen und nach der Elektrophorese aus dem Gel geschnitten. Auch der Vorgang mit dem Capturepuffer, den Filtereppis ...usw. wiederholte sich noch zwei mal.

Danach haben wir mit der Ligation begonnen. Diese dient daszu, das Insert mit dem Vektor "genetisch zu verkleben"
(In die Ligation kommt u.a. Ligase, ein Enzym dass das Plasmid mit der gewünschten DNA-Sequenz verbindet)
Parallel dazu haben wir Religationen angesetzt, die überprüfen sollen ob sich das Plasmid auch ohne Insert verbindet. Wenn dem so ist, ist wohl irgendetwas schief gelaufen.

Heute haben wir außerdem zum ersten Mal ein Polyacrylamidelektophoresegel gegossen. Dabei geht es um die Auftrennung von Proteinen. Im Gegensatz zur normalen Elektrophorese, gibt es bei der PAAE zwei verschiedene Gele hintereinander:
1) Sammelgel: sorgt dafür, dass alle Proteine auf einer Linie sind, bevor sie übergehen ins
2) Trenngel: hier werden die Proteine der Größe nach aufgetrennt
Dieses Gel braucht auch um einiges länger, wir haben es 2 1/2 Stunden laufen lassen.

Während dieser Zeit durften wir heute mit dem Flo (arbeitet im Nebenlabor) eine Transformation mit E.colis durchführen (genauere Beschreibung folgt demnächst).

Nachdem unser Gel fertig war, haben wir die Proteine auf eine Membran übertragen. Diese haben wir anschließend auseinander geschnitten und in zwei Schälchen gegeben. Diese haben wir mit Antikörper gefüllt und über Nacht bei 10°C auf eine Wippe gestellt.

Die erste Woche ist geschafft und erstaunlich schnell vergangen. Am Fr haben wir den (missglückten) Versuch (Plasmidisolierung + Restriktionsverdau) wiederholt. Diesmal hats zwar geklappt, dafür is der zweite Restriktionsverdau schief gegangen. Wenigstens haben wir (im Nachhinein) unseren Fehler selbst bemerkt.