Nachtrag: 14.7-25.7.2008
11:59 / 28.07.2008
Liebe Leute,
endlich komme ich dazu euch mitzuteilen was ich in den letzten 2 Wochen erlebt habe. Ich hatte so viel zu tun, habe soviel gesehen und meine Tante war auch extra streng :), dass ich nicht eine Minute Zeit hatte, um mir Gedanken zu machen was ich schreiben könnte.
Doch jetzt hat mich die Muse geküsst und ich will euch mal erzählen, was sich bei mir so getan hat:
Am 14.07.08 begannen wir (vier Kolleginnen und ich) mit der Isolierung von RNA aus Plazentagewebe. Wir verwendeten dazu FTP(first trimester plazenta) und TP(term plazenta). Die RNA-Konzentration konnten wir mithilfe von einem Gerät namens Nanotrop messen und ein Kontrollgel durfte natürlich auch nicht fehlen. Das Kontrollgel besteht aus Agarose, TAE und Ethidiumbromid (mutagen, cancerogen!!). ==>> ELEKTROPHORESE
Die RNA benötigten wir dann für die RT-PCR am 15.07.08, dafür bekam ich mein eigenes Primerpaar. Wieder stellten wir ein Gel her. Daraus schnitten wir unser PCR Produkt (im Gel) und froren es bei -20°C ein.
Am 16.07.08 isolierten wir aus den Gelstücken, mittels MiniElute Kit, die DNA. Wir stellten wieder ein Kontrollgel her um die Fragment-Intensität zu beurteilen.
Danach haben wir das PCR-Produkt in den pDrive Vektor ligiert und in kompetente Bakterien transformiert (Hitzschock). Diese vermehrten wir auf sogenannten Platten.
Am 17.07.08 setzten wir ONC's(Flüssigkulturen) für Schnellminis an. Dafür benötigten wir die weißen Kolonien von unseren Platten ( Blaue Kolonien enthalten kein Insert).
Am 18.07.08 machten wir die Schnellminiprep und den Kontrollverdau mit EcoR1, ein Kontrollgel durfte natürlich nicht fehlen.
Am 21.07.08 benötigten wir die ONC's für schöne Minipreps(schön=sauber). Pro Gen suchten wir 2 ausgewählte Klone, die wir dann zur Sequenzierung verwendeten.
Am 22.07.08 machten wir die Vorbereitungen für die In situ Hybridisierung.
Wir stellten Sonden (probe) her, die mit Digoxigenin makiert sind. Dieses Sonden wurden dann zur Hybridisierung am Gewebe verwendet.
Wir linearisierten die Sonden in 2 Richtungen, stellten ein Präparatives Gel her, schnitten die Fragmente aus dem Gel, isolierten die DNA mit dem MiniElute Kit. Dann erfolgte die In vitro Transkription in einem Reaktionsgefäß. Dieser Vorgang dauerte 2.5 h, bei 37°C. Als letztes fällten wir die Sonden mit Ethanol aus. Am 23.07.08 zentrifugierten wir die Sonden, ließen das Pellet trocknen und lösten es. Dann begannen wir mit der In situ Hybridisierung. Wir holten die Plazentaschnitte, die bei -20°C eingefroren waren und trockneten sie. Die Sonden wurden verdünnt und bei 95°C erhitzt, dass kam auf Eis und wurde mit dem Hybridmix versetzt. Je 200 µL/Schnitt kamen auf das Deckglas und dann bei 55°C in die feuchte Kammer. Am 24.07.08 begannen wir mit dem waschen der Schnitte und mit der Detektion mit Anti Dig AP.
Am Freitag den 25.07.08 fotografierten wir unsere Ergebnisse. Es war keine Färbung nachweisbar, die Methode muss noch optimiert werden. Die In situ Hybridisierung wiederholen wir diese Woche noch einmal.
Fazit: Zu viele Köche verderben den Brei!!!!!!
Alles in allem kann ich nur sagen dass ich sehr viel gelernt habe und mit großer Begeisterung dabei war!!!!
endlich komme ich dazu euch mitzuteilen was ich in den letzten 2 Wochen erlebt habe. Ich hatte so viel zu tun, habe soviel gesehen und meine Tante war auch extra streng :), dass ich nicht eine Minute Zeit hatte, um mir Gedanken zu machen was ich schreiben könnte.
Doch jetzt hat mich die Muse geküsst und ich will euch mal erzählen, was sich bei mir so getan hat:
Am 14.07.08 begannen wir (vier Kolleginnen und ich) mit der Isolierung von RNA aus Plazentagewebe. Wir verwendeten dazu FTP(first trimester plazenta) und TP(term plazenta). Die RNA-Konzentration konnten wir mithilfe von einem Gerät namens Nanotrop messen und ein Kontrollgel durfte natürlich auch nicht fehlen. Das Kontrollgel besteht aus Agarose, TAE und Ethidiumbromid (mutagen, cancerogen!!). ==>> ELEKTROPHORESE
Die RNA benötigten wir dann für die RT-PCR am 15.07.08, dafür bekam ich mein eigenes Primerpaar. Wieder stellten wir ein Gel her. Daraus schnitten wir unser PCR Produkt (im Gel) und froren es bei -20°C ein.
Am 16.07.08 isolierten wir aus den Gelstücken, mittels MiniElute Kit, die DNA. Wir stellten wieder ein Kontrollgel her um die Fragment-Intensität zu beurteilen.
Danach haben wir das PCR-Produkt in den pDrive Vektor ligiert und in kompetente Bakterien transformiert (Hitzschock). Diese vermehrten wir auf sogenannten Platten.
Am 17.07.08 setzten wir ONC's(Flüssigkulturen) für Schnellminis an. Dafür benötigten wir die weißen Kolonien von unseren Platten ( Blaue Kolonien enthalten kein Insert).
Am 18.07.08 machten wir die Schnellminiprep und den Kontrollverdau mit EcoR1, ein Kontrollgel durfte natürlich nicht fehlen.
Am 21.07.08 benötigten wir die ONC's für schöne Minipreps(schön=sauber). Pro Gen suchten wir 2 ausgewählte Klone, die wir dann zur Sequenzierung verwendeten.
Am 22.07.08 machten wir die Vorbereitungen für die In situ Hybridisierung.
Wir stellten Sonden (probe) her, die mit Digoxigenin makiert sind. Dieses Sonden wurden dann zur Hybridisierung am Gewebe verwendet.
Wir linearisierten die Sonden in 2 Richtungen, stellten ein Präparatives Gel her, schnitten die Fragmente aus dem Gel, isolierten die DNA mit dem MiniElute Kit. Dann erfolgte die In vitro Transkription in einem Reaktionsgefäß. Dieser Vorgang dauerte 2.5 h, bei 37°C. Als letztes fällten wir die Sonden mit Ethanol aus. Am 23.07.08 zentrifugierten wir die Sonden, ließen das Pellet trocknen und lösten es. Dann begannen wir mit der In situ Hybridisierung. Wir holten die Plazentaschnitte, die bei -20°C eingefroren waren und trockneten sie. Die Sonden wurden verdünnt und bei 95°C erhitzt, dass kam auf Eis und wurde mit dem Hybridmix versetzt. Je 200 µL/Schnitt kamen auf das Deckglas und dann bei 55°C in die feuchte Kammer. Am 24.07.08 begannen wir mit dem waschen der Schnitte und mit der Detektion mit Anti Dig AP.
Am Freitag den 25.07.08 fotografierten wir unsere Ergebnisse. Es war keine Färbung nachweisbar, die Methode muss noch optimiert werden. Die In situ Hybridisierung wiederholen wir diese Woche noch einmal.
Fazit: Zu viele Köche verderben den Brei!!!!!!
Alles in allem kann ich nur sagen dass ich sehr viel gelernt habe und mit großer Begeisterung dabei war!!!!
