Morgen wird mein Praktikum auch schon enden, aber glücklicherweise konnte ich gestern und heute noch einige interessante Sachen machen. Gestern habe ich 2 Zellproben mit einem Durchflusszytometriegerät untersucht, um zu sehen an welcher Stelle des Zellzyklus sie sich befinden. Das Verfahren ist recht einfach: man färbt die Zellen mit einem bestimmten Farbstoff, in diesem Fall einer, der sich in die DNA einlagert. Danach gibt man diese Proben in das Gerät, welches dann mit einem Laser den Farbstoff zum Fluoreszieren bringt und je nach Helligkeit kann man unterscheiden wie viel DNA sich in der Zelle befindet und so bestimmen an welcher Stelle des Zellzyklus sie ist. Der komplizerte Teil sind die Einstellungen in der Software und bei der Auswertung, aber dabei hilft man mir ja sowieso.
Heute war ich vor der Auswertung der Ergebnisse noch in der Orthopädie und habe mir dort das Labor angesehen. Im Gegensatz zum Labor hier beim ZMF sind die Einrichtungen natürlich viel älter, da das Gebäude ja auch deutlich älter ist. Die Geräte sind aber im Grunde die gleichen. Hier werden allerdings mehr Primärkulturen von Gewebeproben kultiviert, wie z.b. nach Operationen. Hier konnte ich auch beim Auftauen von Zellen aus dem Tiefgefrorenen Zustand und bei der Untersuchung von Proben mit einem Photometer zusehen.
Morgen werde ich dann das letzte Mal in der Zellkultur arbeiten und meine Zelllinien splitten und dann zählen. Die 3 Wochen sind wirklich verdammt schnell vergangen und ich werde morgen noch eine kurze Zusammenfassung darüber schreiben, warum es für mich so eine tolle Erfahrung war.
http://de.wikipedia.org/wiki/Durchflusszytometrie
http://de.wikipedia.org/wiki/Zellzyklus

Nach einer weiteren Woche bin ich endlich richtig routiniert beim Arbeiten, aber bald ist das Praktikum auch schon wieder vorbei. Neben den üblichen Arbeiten in der Zellkultur habe ich letzten Donnerstag noch einen Versuch mit ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) gemacht, ein Testverfahren, bei dem man mit Hilfe eines Enzyms, das an einen Antikörper gebunden ist, der sich dann wiederum an das nachzuweisende Antigen bindet. Durch dieses Enzym bildet sich dann ein gewisser Farbton, von dem man auf Menge und Art des Stoffes schließen kann. Die Vorbereitung des Ganzen ist eigentlich nicht so schwer, wenn man der Anleitung genau folgt, das größte Problem ist, dass man alles in eine Mikrotiterplatte bringen muss, was sehr aufwendig ist. Irgendwo scheint mir ein Fehler unterlaufen zu sein, bei mir gab es jedenfalls keine Farbveränderung. Der Versuch hat ca. 4 Stunden gedauert, wobei der Großteil davon Wartezeit war und der kleinere richtiges Arbeiten.

Das Zählen von Zellen mittels eines elektronischen Gerätes ist eigentlich sehr simpel. Diese Messen im Grunde den Widerstand der Zellen und können so ihre Größe und Anzahl bestimmen. Man geht so vor: nach dem Reinigen des Gerätes wird in ein CASYcup(der Name der passenden Messbecher) pippetiert man je nach gebrauchter Verdünnung Zellen(bei HeLa 50µL, bei Jurkat 100µL) und gibt dann 10mL CASYton(eine isotonische Flüssigkeit, die beim Messen benötigt wird) dazu, um es zu verdünnen. Man muss dann noch die Richtigen Einstellungen am Gerät auswählen, die je nach Zelllinie unterschiedlich sind. Danach muss man im Grunde nur noch Start drücken und die Messung wird ausgeführt. Im Normalfall hat man dann schon die richtigen Messwerte, wie z.b. Zellzahl, Größe, Lebensrate etc. am Bildschirm. Nach der Benutzung reinigt man das Gerät wieder, in dem man einen Becher voll CASYton anstatt der Probe ins Gerät gibt und auf Clean drückt.
Das Zählen mit Hilfe einer Zählkammer ist nicht schwieriger, aber deutlich zeitaufwändiger. Hier vermischt man Bromthymolblau 1:1 mit der Zellsuspension. Danach muss man ein paar Minuten warten, während denen man die eigentliche Zählkammer vorbereiten kann: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/4d/Neubauer_improved_counting_chamber.jpg man haucht die Zählkammer an, legt das Deckglas auf und drückt es fest, so dass man die Kammer umdrehen kann ohne dass das Deckglas abfällt und sich Newtonsche Ringe(im Grunde bunte Ringe) sich an den Rändern des Deckglases bilden. Danach kann man etwas von der vorher hergestellten Flüssigkeit in die Kammer geben und kann danach unter dem Mikroskop die Zellen zählen. Man zählt 4 große Quadrate, berechnet den Mittelwert, Multipliziert das mit der Verdünnung und dem Faktor 10^4 und schon hat man die Anzahl der Zellen bestimmt.

Je nach Zellart gibt es 2 Möglichkeiten: Suspensionskulturen und Monolayerkulturen. Bei Suspensionskulturen ist es sehr einfach: man mischt die Zellen mit einer Pipette gut durch, entnimmt einen Teil der Zellen, je nachdem welches Teilungsverhältnis man will, gibt diese in eine neue Kulturflasche und gibt neues Medium dazu. Danach kann man die Zellen schon wieder in den Brutschrank stellen. Bei Monolayerkulturen ist das komplizierter: da diese am Boden der Flasche fest wachsen muss man diese zuerst lösen. Zuerst saugt man das alte Medium ab und spült danach die Zellen mit PBS. Dieses saugt man dann wieder ab und gibt das Enzym Trypsin hinein. Dieses "verdaut" die Verbindung der Zellen mit dem Boden und deshalb lösen sie sich ab. Man stellt die Flasche nun für ca. eine Minute in den Brutschrank, da Trypsin bei 37°C besser wirkt. Man nimmt dann die Zellkultur wieder aus dem Schrank und gibt etwas Medium zu den Zellen und vermischt das Ganze. Je nach gewünschter Verdünnung nimmt man nun wieder einen Teil der Zellen, gibt diesen in eine neue Flasche und gibt neues Medium dazu. Vorsichtig sein sollte man beim Trypsinieren: wenn dieses zu lange auf den Zellen bleibt sterben diese ab, also nie zu lange warten.

Nach 2 Tagen Arbeit endlich Zeit zusammenzufassen, was ich an diesen beiden Tagen erlebt habe. Am Montag hat alles begonnen, als ich etwas aufgeregt ins ZMF hier in Graz gekommen bin. Nach einem freundlichen Epfang durch meine Betreuerin Dr. Beate Rinner, habe ich dann erfahren was das Thema meiner Arbeit sein wird: Der Vergleich verschiedener Zählmethoden für Zellen, nämlich einer elektronischen Zählmethode mit dem Gerät CASY (Cell Counter and Analyser System) und eine Zählmethode mittels eines Hämocytometers(ein sehr koplizierter Begriff für etwas sehr einfaches: Abzählen von Zellen in einem Raster http://de.wikipedia.org/wiki/Neubauer-Z%C3%A4hlkammer ).
Natürlich brauche ich dafür auch Hintergrundwissen, sowohl in der Kultivierung der Zellen, als auch bei der Bedienung der Geräte, aber dank guter Lehrmaterialien und vorallem netter Betreuer, die mir alle sehr nett sämtliche Arbeitsschritte und Geräte erklären.
Am 2. Tag im ZMF habe ich gleich in der Früh zugesehen wie Tumorzellen für die spätere Verwendung in Experimenten vorbereitet werden. Dabei habe ich auch das erste mal den CASY verwendet. Eines dieser Experimente davon habe ich mir gleich danach angesehen, ich habe nämlich die Zellen zum Hahnhof gebracht, wo diese Nacktmäusen injiziert wurden um das Wachstum eines Tumors auszulösen. Die Mäuse mögen einem zwar leid tun, wenn man sieht, wie man ihnen 5 Millionen Krebszellen spritzt, aber leider ist solche Forschung absolut nötig zur Untersuchung von Krankheiten.
Später habe ich das Pipettieren mit einem sogenannten Pipetboy geübt, einer elektronischen Hilfe zum genauen Abmessen der Flüssigkeiten.
Diese Fähigkeit habe ich auch gleich danach gebraucht, als ich das erste mal selbst Zellen für das Zählen vorbereitet habe. Die Vorbereitung für das Zählen mit CASY ist denkbar einfach: man "vermischt" die Zellsuspension möglichst gut, dass sich die Zellen gut verteilen, nimmt 10µL der Suspension und vermischt diese mit 10mL CASYTON, einer isotonischen Flüssigkeit, die man für die Messung braucht, dann reinigt man CASY noch und sobald man die richtigen Messparameter eingestellt hat braucht man nurnoch auf Start drücken und die Ergebnisse stehen innerhalb weniger Sekunden auf dem Bildschirm. Nach der Messung reinigt man den CASY und protokolliert seine Ergebnisse. Die Zählung per Hand ist etwas aufwendiger, da man die Zellen in ein Hämocytometer geben muss, was etwas Fingerspitzengefühl benötigt.
Am Schluss habe ich noch eine Einführung in die Benutzung des CASY im 2. Stock bekommen, der etwas anders Funktioniert als der im Erdgeschoss.
Bis jetzt war alles sehr aufregend und ich freue mich auf mehr