Erlebnisse
11:51 / 29.09.2010
* Western Blot
* Bradford Test
* Zellen Splitten
* PCR
* Klonierung
* Agarose-Gelelektrophorese
* Dünnschichtchromatografie
* Massenspektrometer
* Microarray (RNA isolieren)
* Plasmidpräparation (Maxiprep und Miniprep)
* Zellen einfrieren (-180° in Isopropanol)
* Cell Viability Assay
ich weiß nicht wie viel es bringt alles theoretisch genau zu erklären, denn in Wiki bzw in google steht bereits alles.
Western Blot:
Eine Schicht Gel; + Isopropanol (verhindert Schaumbildung) und dann wegschütteln; + 2 Schicht Gel + Kamm (schief hineinschieben, damit keine Bläßchen entstehen); + Running Puffer, dann Elektrophorese (Proteine wandern durch das Gel, je mehr man ladet, desto schneller wandern sie); durchgelaufene Proteine auf Membran übertragen, also blotten (3 Filter + Gel + Membran + 3 Filter); Blocken (mit Milchpulver); "Waschen" (mit Puffern); Membran in Falcons hineingeben + 1 Antikörper -> übernacht in Kühlkammer
Membrane herausnehmen, wieder waschen; 2 Antikörper drauf (warten 1h), waschen, ECL (ein Chemilumineszenz) auftragen, Membrane in Hypercassette tun + Filmpapier-> in Dunkelkammer entwickeln.
Ziel: Marker zeigt die kDas (also Protein Ladder) und die Proteine sollen dann am bestimmten Stellen sichbar sein (schwarze Banden). Verschieden große Proteine brauchen verschieden dichte Gele (je kleiner, desto dichter).
Bradford Test:
Proteine (in aufsteigender Menge, also 0, 5, 10, 15 etc. mikrometer) werden in Säulen hineinpepittiert; + CBBG ; mixen; nach der Reihe in einer Maschine photometrisch gemessen.
Ziel: Maß für die Proteinkonzentration der Lösung bestimmen. (wird daher manchmal vor Western Blot gemacht)
Zellen Splitten:
Es gibt schwimmende Zellen und am Bodenhaftende Zellen, daher gibt es auch 2 verschiedene Methode wie man sie splittet.
"bodenständige Zellen": altes Medium wegsaugen; + 10ml PBS (damit kein Medium mehr übrigbleibt); PBS wegsaugen; Trypsin (2ml) löst die Zellen vom Boden (5min warten, 37°); + neues Medium (ca. 10ml); splitten (1:2 oder 1:3, kommt drauf an wie schnell sie wachsen); in neuen Petrischalen + neues Medium; in Inkubator stellen
"schwebende Zellen": Zellen von Kulturflaschen in Falcons überführen, zentrifugieren; Medium vorsichtig absaugen; PBS; + neues Medium; splitten;l in neue Petrischale; + neues Medium
* Bradford Test
* Zellen Splitten
* PCR
* Klonierung
* Agarose-Gelelektrophorese
* Dünnschichtchromatografie
* Massenspektrometer
* Microarray (RNA isolieren)
* Plasmidpräparation (Maxiprep und Miniprep)
* Zellen einfrieren (-180° in Isopropanol)
* Cell Viability Assay
ich weiß nicht wie viel es bringt alles theoretisch genau zu erklären, denn in Wiki bzw in google steht bereits alles.
Western Blot:
Eine Schicht Gel; + Isopropanol (verhindert Schaumbildung) und dann wegschütteln; + 2 Schicht Gel + Kamm (schief hineinschieben, damit keine Bläßchen entstehen); + Running Puffer, dann Elektrophorese (Proteine wandern durch das Gel, je mehr man ladet, desto schneller wandern sie); durchgelaufene Proteine auf Membran übertragen, also blotten (3 Filter + Gel + Membran + 3 Filter); Blocken (mit Milchpulver); "Waschen" (mit Puffern); Membran in Falcons hineingeben + 1 Antikörper -> übernacht in Kühlkammer
Membrane herausnehmen, wieder waschen; 2 Antikörper drauf (warten 1h), waschen, ECL (ein Chemilumineszenz) auftragen, Membrane in Hypercassette tun + Filmpapier-> in Dunkelkammer entwickeln.
Ziel: Marker zeigt die kDas (also Protein Ladder) und die Proteine sollen dann am bestimmten Stellen sichbar sein (schwarze Banden). Verschieden große Proteine brauchen verschieden dichte Gele (je kleiner, desto dichter).
Bradford Test:
Proteine (in aufsteigender Menge, also 0, 5, 10, 15 etc. mikrometer) werden in Säulen hineinpepittiert; + CBBG ; mixen; nach der Reihe in einer Maschine photometrisch gemessen.
Ziel: Maß für die Proteinkonzentration der Lösung bestimmen. (wird daher manchmal vor Western Blot gemacht)
Zellen Splitten:
Es gibt schwimmende Zellen und am Bodenhaftende Zellen, daher gibt es auch 2 verschiedene Methode wie man sie splittet.
"bodenständige Zellen": altes Medium wegsaugen; + 10ml PBS (damit kein Medium mehr übrigbleibt); PBS wegsaugen; Trypsin (2ml) löst die Zellen vom Boden (5min warten, 37°); + neues Medium (ca. 10ml); splitten (1:2 oder 1:3, kommt drauf an wie schnell sie wachsen); in neuen Petrischalen + neues Medium; in Inkubator stellen
"schwebende Zellen": Zellen von Kulturflaschen in Falcons überführen, zentrifugieren; Medium vorsichtig absaugen; PBS; + neues Medium; splitten;l in neue Petrischale; + neues Medium
