Blog:

Hallo,
na, jetzt hab ich aber schon lange nicht mehr geschrieben.
Also leg ich mal gleich los:

Tag 3:

So, heute war es also da, das heißersehnte Ergebnis unserer DNA-Extraktion/PCR. Bei der Gelelektrophorese sollte sich zeigen, ob in unseren Proben auch wirklich DNA enthalten war.
Uuuund (Trommelwirbel)
es war natürlich nichts zu sehen :D
Also was tun?
Zuerst einmal alle DNA-Proben 1:10 verdünnen. (Vielleicht war die DNA ja zu konzentriert) Also nochmal Master-Mix, nochmal PCR, nochmal Gelelektrophorese.
Uuund?
Tja, zumindest bei drei oder vier Proben sah man eine feine Bande (heller oranger Strich unter UV-Licht). Also was folgert man daraus?
Genau, die Primer sind kaputt. (Wer würde schon die Praktikantinnen beschuldigen?
Nein, es waren echt die Primer)
ALSO: Neuer Master-Mix mit neuen Primern, erneute PCR und wieder Gelelektrophorese und siehe da, es sind viel mehr Banden sichtbar :)
Während der PCR gingen wir noch einmal runter in den Garten, um neues Pflanzenmaterial, dass wir zum Isolieren von Mikrosatelliten aus der Pflanzen-DNA brauchen würden, zu holen. Dieses trockneten wir, um morgen die DNA daraus zu extrahieren.
Nach dieser Prozedur erhielten wir von Herrn Pfosser noch eine theoretische Einführung in das Isolieren von Mikrosatelliten, das unser nächstes Aufgabengebiet sein wird. (Uns war nämlich der Red-taq-Ready-Mix ausgegangen, ein wichtiges Utensil für die PCR, den wir aufgrund von Lieferschwierigkeiten erst für Montag erwarteten. Also: Keine PCR möglich.
Zwischendurch kam einmal ein Herr mit einer Pflanze im Korb vorbei, die er bestimmt haben wollte, da es Tags davor einen Fernsehbericht über die für Allergiker gefährliche Pflanze Ambrosia (auch Beifußblättriges Traubenkraut genannt. Siehe Wiki :o) ) gegeben hatte. Es war diese Pflanze und Herr Pfosser riet dem Herrn die Pflanze aus seinem Garten zu entfernen.

Tag 4:

Heute haben wir die DNA der letzten 3 Pflanzenproben extrahiert und auch die der „Extra“-Probe (auch * genannt :o) ), die wir für das Isolieren von Mikrosatelliten benötigen würden. Außerdem stand wieder einmal eine Wiederholung der PCR von gestern an. Da wir keinen Red-taq-Ready-Mix mehr hatten, gab uns Herr Pfosser einzeln Polymerase und PCR-Buffer , die wir statt dem Ready-Mix verwendeten. Nachdem der Master-Mix fertig war, gaben wir 2µl DNA der Proben in 1:1 und 1:10 Verdünnung dazu und gaben sie in die PCR. Danach fügten wir noch einen Farbstoff hinzu und gaben die Proben in das Agarosegel der Gelelektrophoresevorrichtung und starteten diese. Als wir das Gel unter UV-Licht betrachteten, sahen wir das ernüchternde Ergebnis: Keine Banden! Was folgt daraus? Genau, die Polymerase war kaputt. Während die PCR lief bereiteten wir das LB-Medium für die Bakterien, die wir bei der Isolation von Mikrosatelliten benötigen würden, vor. Dazu mischten wir einfach etwas LB-Pulver mit Agar-Agar (so eine Art Gelatine) und ddH2O. Dies Autoklavierten wir zunächst, um es dann in (auch autoklavierte) Petrischalen zu füllen, fest werden zu lassen, die Bakterien (e.choli) darauf zu geben und bei 37° zu lagern. Dann erklärte uns Herr Pfosser noch einen Transformation Kit für Schulen, den wir als Vorbereitung zur Mikrosatelliten Isolation machen sollten. (Für die Isolation von Mikrosatelliten muss man nämlich Bakterien transformieren.) Dabei wird dem Bakterium e.choli ein Gen einer Qualle, das dafür sorgt, dass die Qualle bei Bestrahlung mit UV-Licht leuchtet, eingepflanzt. Bei Zusatz von Arabinose, welche das Gen aktiviert, leuchtet, sofern die Transformation funktioniert hat, auch das Bakterium unter UV-Licht grün.

Tag 5:

Zuerst beschlossen wir eine neue PCR/Gelelektrophorese für alle Proben (insg. 37) anzusetzen, da der Red-taq-Ready-Mix doch schon heute geliefert worden ist.
Bei der Beleuchtung des Agarosegels, nach abgeschlossener Elektrophorese, sah man zu unserer Freude bei fast allen Proben Banden.
Dann besprachen wir noch einmal die einzelnen Schritte der Bakterien Transformation, da wir diese am Montag und Dienstag während der Abwesenheit von Herrn Pfosser machen würden. Nun schauten wir ob unsere Bakterien auch gewachsen waren. Da wir sie nur einen Tag kultiviert hatten, waren die Bakterienkonlonien nur unscheinbare kleine Punkte. Von diesen Kolonien suchte sich jeder eine aus und pflanzte sie auf eine andere Petrischale um. Dazu nahmen wir einen autoklavierten Zahnstocher und nahmen die Kolonie damit auf und verteilten sie auf der anderen Platte. Danach gab uns Herr Pfosser Primer für eine neue DNA-Sequenz (Abschnitt der DNA), die wir auch untersuchen sollten. Deshalb machten wir wieder von allen Proben PCR und Gelelektrophorese. Auch diesmal hatten wir ziemlich gute Ergebnisse. (Was wenn man die letzten PCR's bedenkt doppelt erfreulich war :o) )
Als letztes bereiteten wir LB-Ampicilin– Arabinose Platten für die Bakterien Transformation vor. (Ampicilin ist ein Antibiotika, gegen das unsere Bakterien nach der Transformation aber immun sein sollten. Arabinose ist ein Zucker der das Quallengen aktiviert. Ist keine Arabinose vorhanden können auch transformierte Bakterien nicht leuchten.)

Tag 6:

Heute ist der erste Tag an dem wir ganz ohne Herrn Pfosser arbeiten. Zuerst werteten wir die Statistik zu Haplogruppen nach PLZ aus. (Bei der Evolutionsausstellung im Schlossmuseum konnte man seine Haplogruppe testen lassen.) Dann begannen wir mit der Bakterien Transformation. Dabei gingen wir nach einem beigefügtem Protokoll vor. (Mit ein paar kleinen Änderungen in der Auswahl der Geräte) Dann schrieben wir die Ergebnisse der PCR's in eine Liste zusammen und wiederholten die nicht gelungenen in 1:10 Verdünnung. Dann stellten wir noch ein neues Agarosegel her. Nun warfen wir einen Blick auf unsere Bakterienkolonien, die übers Wochenende rapide gewachsen waren. Am Nachmittag stattete uns Steffis Mutter einen Besuch ab. Sie erzählte uns wie sie zu ihrer Zeit als MTA im Labor gearbeitet hat und welche Geräte sie damals noch benutzten.

Tag 7:

Heute war der zweite und letzte Tag ohne Herrn Pfosser. Als erstes guckten wir gleich nach unseren Bakterien von gestern. Nur leider waren auf den positiv gekennzeichneten Platten keine Bakterien zu sehen. (Wir hatten 4 verschiedene Platten, zwei mit untransformierten und zwei mit transformierten Bakterien. Bei den negativ-Proben war alles wie es sein sollte (einmal Bakterien, einmal nicht), bei den positiv leider nicht.) Wir vermuten, dass der Fehler am Hitzeschock lag (von Eis auf 42°C und zurück). Dann machten Marietta und ich uns daran Tortendiagramme zu der gestern ausgewerteten Statistik zu machen. Steffi machte derweil die Gelelektrophorese der gestrigen PCR-Produkte. Die (kargen) Ergebnisse trugen wir in unsere Liste ein. Dann machten wir von den bisher erfolglosen Proben eine erneute PCR in anderer DNA-Verdünnung. Während die PCR lief machten wir Mittagspause und gingen zu Mc'Donalds essen :D
Nach der Gelelektrophorese trugen wir die Ergebnisse wieder in die Liste ein und beschlossen wegen der noch immer erfolglosen Proben und den nicht vorhandenen Bakterien morgen Herrn Pfosser zu fragen.

Tag 8:

So, heute war Herr Pfosser wieder da und sogleich erzählten wir ihm mit betretenen Gesichtern, dass unsere (vermeintlich) transformierten Bakterien unter UV-Licht nicht leuchten. Um sich selbst noch einmal zu versichern ob die Transformation wirklich nicht geklappt hat gingen wir mit Herrn Pfosser extra in einen abgedunkelten Raum um unsere Bakterien mit UV-Licht zu beleuchten. Aber keine grün leuchtenden Bakterien :(
Also besprachen wir den ganzen Vorgang noch einmal durch um einen etwaigen Fehler zu finden. Dazu haben wir jetzt zwei Theorien:
1) Die Bakterien wurden nicht transformiert weil der Hitzeschock nicht ausreichend war. Wir haben die Bakterien nämlich statt in ein 42°C heißes Wasserbad in den Inkubator gegeben.
2) (und die viel bessere Möglichkeit :o) )
Die Bakterien sind auf den Platten, aber sie sind noch in zu geringer Anzahl vorhanden um sie zu sehen bzw. um zu leuchten. (Das könnte daher kommen, dass wir sie nicht über Nacht bei 37°C sondern bei Zimmertemperatur gelagert haben.)
Deshalb haben wir die Bakterien jetzt bei 37°C gelagert und werden sie auch übers Wochenende noch wachsen lassen.

Aber nun zu fröhlicherem: Heute haben wir eine neue Aufgabe bekommen :o)
DNA-Sequenzieren (kurz gesagt: Den Code der DNA sichtbar machen, d.h. die Basenabfolge bestimmen.)
Herr Pfosser erklärte uns den Vorgang sehr anschaulich anhand einer Skizze. (Das ganze ist ziemlich interessant, aber wird wohl Bestandteil der Forschungsdoku. Wobei ich nicht weiß wie ich mit nur 5 (!) Seiten auskommen soll...)
Dazu suchten wir uns zuerst einmal die PCR-Produkte jener Proben die mit beiden Primern gute Ergebnisse gezeigt haben zusammen. (24 Proben pro Primer)
Dann versetzten wir die Proben mit Enzymen, um sie von den noch von der PCR übrig gebliebenen Nukleotiden und Primern zu säubern. Dann starteten wir ein spezielles Programm der PCR-Maschine. Sie erwärmte die Proben zuerst 15min lang auf der Temperatur, bei der die Enzyme am besten arbeiten, dann erhöhte sie die Temperatur auf 60°C um die Enzyme wieder zu vernichten (sie sind hitzelabil). Denn die Enzyme würden die weitere DNA-Sequenzierung stören. Anschließend froren wir die Proben für die weitere Verarbeitung ein.

Außerdem haben wir heute noch die Mikrosatelliten Isolation vorbereitet. Dazu stellten wir ein neues Agarosegel her. (Mit extra breiten Kammern.) Dann gaben wir 9µl Farbstoff zu unserer Spezial-*-Probe und ich pipettierte diese in das Gel. (Was keine leichte Aufgabe war, da das ganze durch die viele DNA ziemlich zähflüssig war.) Nachdem wir die Elektrophorese einige Minuten laufen gelassen hatten schnitt Herr Pfosser einen Streifen des Gels auf den unsere DNA war mit einer Skalpellklinge heraus. Unter dem UV-Licht schnitt er dann genau die DNA heraus die als orange leuchtende Bande zu erkennen war. Diese teilte er und gab sie in zwei Epis.
Nach einem Protokoll lösten wir dann das Gelstückchen mit der DNA auf und reinigten es solange bis nur noch die reine DNA übrig blieb. Diese froren wir anschließend bei -20°C ein.

So, jetzt bin ich endlich wieder up-to-date :o)
(obwohl ich nicht versprechen kann, dass ich das bleiben werde)
Falls euch noch etwas interessiert einfach fragen :o)
(oder zu Marietta's Blog schauen, die macht ja auch dasselbe :o) )

Bis ähm... irgendwann mal B)
Johanna

Hallihallo, da bin ich wieder :o)

Leider hatte ich gestern überhaupt keine Zeit zu bloggen, also gibt's heute gleich zwei Tage auf einmal:

Tag 1:
Also mein erster Tag als summerschool-Praktikantin begann, nachdem ich meine Kolleginnen Marietta (auch summerschool) und Steffi (ehem. summerschool-Praktikantin, jetzt "normale" Praktikantin) kennenlernte, gleich mal mit dem Einräumen des Labors. Denn da das Labor umgebaut wurde waren alle Laborgeräte und -utensilien in Kisten verpackt.
Nachdem die wichtigsten Utensilien ausgepackt waren, begannen wir damit neue Pipettenspitzen in die dafür vorgesehenen Boxen zu schlichten.
Danach wurden die Spitzen und auch ein paar Epis autoklaviert (in einen riesigen Celomat geschmissen ;o))
Nach der Mittagspause sammelten wir das Pflanzenmaterial für unsere Versuche (insgesamt waren es 26 Proben) und trockneten diese anschließend.
Dann bereiteten wir noch alles für den morgigen Tag vor und gingen das Versuchsprotokoll durch.
Zwischendurch wurden wir noch von einem begeistertem Pilzsammler besucht, der uns Fotos von einer Riesen("Pizza")-Morchel zeigte :o)

Tag 2:

So, heute am 2. Tag meines Praktikums wurden Marietta und ich endlich angemeldet :D (leider sind nämlich so gut wie alle Sekretärinnen gleichzeitig auf Urlaub...)
Um 9 legten wir auch dann gleich mit der Arbeit los. Zuerst beschrifteten wir die Proben neu (natürlich protokollierten wir immer mit, da die Proben 2x neue Nummern bekamen :o) ) und sortierten die noch nicht ganz trockenen Proben aus.
Aus den getrockneten extrahierten wir die DNA. Dabei folgten wir einem Protokoll, was die Arbeit extrem erleichterte. Dennoch zeigte und Dr. Pfosser noch einige "Tricks", die wir gut gebrauchen konnten.
Genaueres darüber werde ich wohl in meiner Forschungsdokumentation schreiben.
Nach dem Exthrahieren folgte eine PCR. Da diese 3h dauert, richteten wir nur noch das Agarosegel für die Gelelektrophorese her, die wir morgen durchführen.
Dann werden wir auch wissen, ob in den Proben DNA vorhanden ist oder ob wir Wasser pipettiert haben :o)

Bis dann,
Johanna

Hallo allerseits,

ich heiße Johanna, bin 17 Jahre alt und werde ab 4. August ein GEN-AU-summerschool-Praktikum im Biologiezentrum in Linz machen. Mein Betreuer ist Dr. Martin Pfosser. Beim Bewerbungsgespräch wurde mir schon ein bisschen etwas über mein bevorstehendes Praktikum erzählt. Ich werde zusammen mit einer weiteren summerschool-Praktikantin im Labor des Biologiezentrums arbeiten und mich näher mit einer bestimmten Pflanze (deren Name ich noch nicht kenne) befassen.
Ich freue mich schon sehr auf das Praktikum und bin schon gespannt was alles auf mich zukommt. Zwar habe ich schon etwas Laborerfahrung durch die Schule, aber ich bin sicher es gibt noch viel zu entdecken :o)

Bis bald,
Johanna