Heute war der Tag kurz und leicht.
Hab die Kulturplatten die ich gestern neu überstrichen habe auf Mikroskopproben präpariert und hab sie mir dann unter dem Mikroskop angeschaut.
Das habe ich so ziehmlich 2-3 Mal gemacht und bin dann nach Hause geganen

Als erstes mal wieder eine Elektophoräse von den PCR-Produkten von gestern ---> positiv
Nachdem ich die PCR gereinigt habe, habe ich wieder schneideansätze zusammengemischt für eine spätere Ligation.
Nach dem die Ligation fertig war habe ich via Elektroporation die neuen veränderten Plasmide in E.Coli eingesetzt und das Produkta dann wieder auf LBA-Platten aufgetragen.
Sonst habe ich noch ein paar Kulturen von alten Platten auf neue Platten gestrichen

Gleich am Anfang gabe es mal wieder lustige Röhrchen-überfüllungsarbeiten: Aus den Kulturen die ich gestern angezüchtet habe, habe ich 1,5mL entnommen, pelletiert und das Pellet wieder in einem neuen Röhrchen resuspendiert. Danach habe ich die neu angesetzten Röhrchen für rund 1 Std. in den 30C° Schüttler gestellt.
Gleich danach habe ich Plasmidschneideansätze hergerichtet um zu überprüfen ob in meinen Kolonien auch die gewünschte DNA-Sequenz da ist.
Danach habe ich wieder eine neue PCR angesetzt, da wieder einige Kulturen negativ waren.
Danach habe wir uns die ONCs und den heutigen Röhrchen am Mikroskop angeschaut.

Heute war es heiß.
Gleich zu beginn habe ich 3 neue Kulturen in Röhrchen angelegt für die spätere Trafo.
Nachdem gestern nur eine Kultur von den Röhrchen 2 positive Ergebnisse hatte musste ich heute das ganze mit der anderen Kultur wiederholen.
Danach machte ich mal wieder einen PCR-Cleanup für die PCR-Produke von gestern.
Nun der Spannende Moment: Elektrophoräse von PCR Produkten und Röhrchenkulturen die ich neu anlgen musste.
In der Röhrchenkulturen war viel DNA, aber es gab keine zweit Banden, jedoch sollten die Enzyme diese rausgeschnitten haben ergo ---> wieder nix das ist etwas größeres schief gegangen.
Dann zweites mal staunen, die PCR die die letzen 2. mal funktioniert hat war zwar zu sehen, aber sehr sehr schwach und im falschen Massrulerrange ergo ---> Fehlgeschlagen
Irgendwie etwas komisch :S
Danach machte ich eine Trafo von der Funktionierenden Röhrchenkultur und den funktionierenden PCR-überbleibseln mit den Röhrchenkulturen von heute in der Früh, danach ging ich nach Hause nach dem die ärgste Hitze vorbei war

Hurra, was neues! Elektrophoräse
Wieder ging es um die PCR die einfach nicht funktionieren wollte, wir haben nochmals alles verfügbaren Proben rausgekramt und dann eine Elektrophoräse gemacht:
Ein einziges war Positiv, naja wenigstens etwas...
Mit dieser Positiven Probe habe ich dann sofort eine PCR angesetzt.
Danach machte ich eine "Mini-Prep" von dem Röhrchen mit den E.Coli Kolonien. Dadurch habe ich die Plasmide, welche im E.Coli waren, isoliert. Von diesen Isolierungen habe ich ein Proben genommen, diese mit Enzymen geschnitten und hab dann eine Elektrophoräse durchgeführt.
Denn die Enzyme schneiden die gewünschte DNA-Sequenz ruas und so können wir sehen ob die Stämme sie beinhalten. Von 8 Röhrchen haben 2 diese Sequenz gehabt. Herr Natte meinte es wäre ein guter Schnitt.
Danach gab es wieder eine Elektophoräse für das gestrige PCR-Produkt, es war positiv (endlich).
Nachdem diese PCR-positiv war mischte ich gleich 8 neue PCR-Tubes an und lies das PCR-Gerät über Nacht laufen.

Heute etwas neues: Mikroskopieren!
Herr Natter und ich beobachteten die 6 Kolonieren die wir in Röhrchen angezüchtet haben, alle hatten die Gensequenz dirnnen die sie haben sollten.
Danach habe ich die 6 Röhrchen Kulturen auf Platten aufgetragen und in den Brutkasten gestellt.
Seit geraumer Zeit habe ich versucht eine PCR zum laufen zu bringen, jedoch hat sie nie funktioniert, da der Chemie-Diplomand der neben mir arbeitet es auch nicht zusammengebracht hatte, haben wir alte Proben ausgegraben und diese dann als PCR-Template genommen.
Zum Schluss habe ich noch 8 LB-Röhrchen mit den Plasmiden von der E.Coli Trafo vom Freitag beinft und in den Brutkasten gestellt.

Als erstes mal gleich die PCR Produkte vom vorigen Tag reinigen und dann nochmal via Elektrophoräse bestimmen wieviel vom DNA-Material da ist.
Wie gewönlich alles O.K.
Gleich darauf führte ich eine Ligation durch von einem Plasmid und 2 "Inserts" (Inserts sind kleine DNA-Sequenzen die in das Genom oder Plasmid eingeschleust werden).
Damit auch Kulturen wachsen habe ich die ligirten Plasmide in E.Coli transformiert und dann auf LBA platten gestrichen.
Tja dieser Tag war recht kurz und konnte dann so um 14:30 herum nach hause gehen da die Kulturen jetzt auf den LBA Platten wachsen mussten

Heute war nicht so viel zu tun:
Habe wieder mal die PCRs von gestern via Elektrophoräse analysiert und bin zu folgendem Ergebnis gekommen:
SEC14 hat tadellos funktioniert und GFP-nat hat nicht funktioniert.
Nichts desto trotz habe ich alle SEC14 PCR produkte zusammen gepoolt und sie mit einem PCR-clean-kit gereinigt.
Als letztes mixte ich die Ausgangsstoffe für die morgige Transformation zusammen. Das waren zum einen das Plasmid und die beiden SEC14 inserts. Danach durfte ich gehen

Nachdem die PCR von GFP-nat nicht funktioniert hatte musste ich eine neue ansetzen dazu musste ich eine weiter PCR für SEC14 anlegen um mehr Material zu bekommen.
Zurück zu den Hefekulturen von gestern:
Beide Hefekulturen sind gut herangewachsen und ich entnahm etwas von dieser Kultur und mengte es einem YPD-Röhrchen zu. Dadurch hatte ich insesagt 3 Röhrchen:
dyn1, tub3 und den Wildtyp als Kontrolle.
Außerdem führte ich noch eine "mini-prep" durch um aus den Kulturen von TGL4 pNGCU und YOR die DNA zu extrahieren.
Hört sich leicht an, jedoch dauern diese ganzen Sachen relativ lang und so war ich von ca. 8 uhr bis 16 uhr im Labor!

Und um 8 Uhr ging es schon los
Als erstes habe ich wieder eine PCR angesetzt für ein Hefegenom mit GFP und SEC14.
Gleich darauf kam eine 2. PCR mit wieder einem Hefegenom und GFP aber mit "nat".
Während die PCRs liefen strich in neue Hefekulturen auf ARGA-Platten zusammen mit Herrn Natter.
Nach einiger Zeit waren die PCR fertig und ich führte wie gehabt eine Elektophoräse durch um zu schauen ob's geklappt hat:
Für die Hefegenome mit dem SEC14 hat es geklappt, jedoch wurde aus dem GFP-nat nichts, dass heißt das ich morgen diese PCR wiederholen kann.

8:16
Kleines Gespräch mit Herrn Natter, danach ein paar Pipitierversuche mit den Samplern.
9:10
Meeting der Forschungsbelegschaft
9:50
Einweisung von Herrn Natter bezüglich meiner ersten Aufgabe:
PCR von einem Plasmid!
So was brauchen wir alles?
Wasser in der die Reaktion statt findet, einen Puffer, welcher für einen bestimmten pH-Wert sorgt und wichtig für das Enzym ist. Dann brauchen wir die dNTPs, welche die Bausteine für die DNA sind. Weiters kommt das Template bzw. das Plasmid welches wir amplifizieren wollen sowie die Primer, welchen den Abschnitt bestimmen den wir amplifizieren wollen vom Plasmid. Ganz zum Schluss kommt das PWO oder Enzym, welches essenziell ist für die Polymerase.
Nach dem alle Zutaten zusammengemischt wurden, hab ich sie noch gut vermisch und gleich ins PCR-Gerät gestellt.
Nach dem das Plasmid polymerisiert wurde, musste ich noch feststellten ob es geklappt hat. Das geht am Besten mit der Elektrophoräse:
Einfach ein Gel anfertigen welches ein paar Schlitze beinhaltet, wo dann die PCR-Ergebnisse eingefüllt werden.
Das ganze Gelpad wird in eine kleine Wanne gelegt, welche eine Kathode und Anode besitzt. Weiters wird ein Marker in eine Gelpad kammer eingefüllt, welcher später als Messlatte fungiert. Zu guter letzt wird ca. 1 mycroliter von der PCR-Substanz mit Wasser und Farbstoff vermischt und dann in die Geldpad kammern eingefüllt.
Dann Deckeldrauf und die Wanne unter Strom setzen. Nach ca 35-45 Minuten nimmt man das Gelpad raus und Fotografiert es, auf dem Foto is dann eindeutig zu erkennen ob es geklappt hat.
In meinem Fall hat es funktioniert.

Hallo!

Im zuge der GEN-AU SummerSchool arbeite ich in der Molekularbiologie auf der Uni-Graz.
Daweil, bin ich mir noch nicht ganz sicher was ich mache, jedoch weiß ich, dass das Forschungsteam gerade Grundlagenforschung am Projekt GOLD leistet.
Mein derzeitiger Betreuer und Ansprechspartner Dr. Natter hat mir im kurzen beschrieben, dass sie den Fettstoffwechsel im menschlichen Körper gerade unter die Lupe nehmen.
In einer Woche werde ich nocheinmal ein Gespräch mit Dr. Natter führen, dabei werden wir konkret festlegen, was ich machen darf.
Ich freue mich schon darauf, besonders auf die Säure die DNA-Sequenzen zum leuchten bringt, aber zu Mutationen an einem lebendigen Organismus führen kann! Science Fiction lässt grüßen!


Bis auf weiteres euer

Johannes