Sehr traurig aber wahr … Heute ist schon der letzte Tag meines Praktikums auf der Uni Salzburg gewesen. Die Zeit dort ist wirklich wie im Flug vergangen und ich hätte nichts dagegen gehabt, noch etwas länger zu bleiben. Allerdings war dieser Abschied wirklich noch mal so richtig toll. Denn heute durften wir eigentlich so gut wie alleine arbeiten. Da unsere Betreuer beide zur wöchentlichen Laborbesprechung mussten, hatten sie natürlich keine Zeit für uns. Wir wollten aber klarerweise trotzdem gerne arbeiten und daher machten wir es dann selbstständig. Selbstverständlich hatten wir das zuvor abgesprochen. Die Arbeitsschritte hatten wir ja schon des öfteren gemacht (jajaa unsere Klonierung war schließlich nicht vom Glück verfolgt und wir versuchten dem Problem mit vielen Versuchen auf die Spur zu kommen) und daher trauten wir (und auch Helene und Wolfi) uns das selbstständige Arbeiten schon zu.

Die Aufgabe war nun, unsere Bakterienplatten zu betrachten – darauf befanden sich glücklicherweise jede Menge Kolonien – und sie zu picken. Wie gewohnt pickten wir die Klone in mit Wasser gefüllte Eppis und legten außerdem eine Masterplate an. Diesmal machten wir aufgrund der großen Anzahl der Klone gleich 2. Eine für Puro und eine für Neo. In die Eppis gaben wir jeweils einen Klon der

Religationen (1x Relig Puro, 1x Relig Neo)
und dann 16 Klone von Neo + Sufu
und 14 Klone von Puro + Sufu

wobei wir beim Puro die letzen 4 (10-14) jeweils als eine 5er Kolonie pickten. D.h. wir pickten in 5 verschiedene Klone und gaben sie zusammen in ein Eppi. Auf der Masterplate und auch auf den anderen Bakterienplatten beschrifteten wir dann auch ganz genau, wo sich welche Klone befanden, damit man sich später auch noch auskennen konnte. Das war auch etwas, dass wir in den letzen 3 Wochen definitiv gelernt hatten: alles immer so genau wie möglich zu beschriften. Sodass man es immer noch genau definieren kann und womöglich sogar anderen zur Verfügung stellen kann. Ein wichtiger Aspekt, ohne den man schon mal ziemliche Probleme bekommen kann und die harte Arbeit umsonst war.
Die Eppis wurden dann mit dem gewohnten grünen Gotaq und einem Primermix versetzt und kamen in die PCR. Helene hatte uns am Vortag schon die genaue Bedienung erklärt und daher war das kein Problem. Das Programm war eingespeichert und der Rest war kinderleicht. Kurze Schwierigkeiten bereitete uns nur die Tatsache, dass die PCR am Morgen bei unserem Eintreffen bereits voll besetzt war. An der Anzeige konnten wir aber ablesen, dass das Programm schon fertig war und nur noch die Proben so drin waren. Da wir aber keine fremden Proben entfernen wollten, fragten wir vorher, was wir damit tun sollten. Schlussendlich nahmen wir sie heraus, stellten sie bei uns in den Kühlschrank und klebten einen Zettel mit dem besagten Ort auf die PCR. Später stellte sich dann heraus, dass es Doris Proben waren und das mit dem Herausnehmen kein Problem war. Ja und nun war genug Platz für unsere Eppis. Alles rein damit und warten. In der Zwischenzeit gossen wir ein großes Gel für alle 32 Proben. Außerdem hatte auch Doris noch eine kleine Aufgabe für uns. Wir sollten ihre PCR-Proben auf ein Gel auftragen. Was für eine Ehre1  Denn ein Fehler könnte ziemlich viel ihrer Arbeit zunichtemachen und daher bemühten wir uns natürlich besonders. Das Ergebnis sah jedoch super aus – ein Glück – und so konnten wir wirklich zufrieden sein. Nebenbei trugen wir auch unsre Proben auf das Gel auf und ließen den Strom laufen.

Dann, der große Moment unterm UV-Licht. Würden wir diesmal endlich positive Klone haben?! NEIN. Leider wieder nicht. Sehr enttäuschend aber ok. Immerhin hatten wir sonst alles richtig gemacht – und zwar alleine – und darauf konnten wir doch stolz sein. Am Schluss noch ein Foto und aus. Gel konnte wieder mit Genuss zerstört werden.

Zum Abschied schossen Conny und ich dann noch einige Fotos vom Labor inklusive uns (hey ja Erinnerung muss sein und schließlich wollen wir zu Hause ja auch damit angeben). Großes Verabschieden von allen noch und vorbei wars.
Ich muss sagen das Praktikum war sogar noch besser als ich es mir vorgestellt habe und ich bin wirklich sehr glücklich, dass ich die Chance hatte, dass zu erleben. Bei der Arbeit im Labor konnte ich nicht nur theoretisch unglaublich viel über die Grundzüge der Genetik lernen sondern auch die Techniken dann sofort im Labor praktisch anwenden. Dadurch war die ganze vorherige Information auch sofort viel besser zu verstehen und die einzelnen Arbeitsschritte erschienen viel logischer.

Es ist mir auch klar, dass diese Chance wirklich einmalig gut war und mir nicht nur Wissen zur Genetik sondern auch noch viele Nebeninformationen zu Studium und Beruf gebracht hat. Das wird meine Studienwahl bestimmt beeinflussen und mich mehr Faktoren beachten lassen. Aber da hab ich zum Glück ja jetzt noch ein Jahr zeit.

Der Donnerstag war ein eher gemütlicher Tag. Daher fällt mein heutiger Beitrag auch etwas kürzer aus. Die Ligation hatte ja über Nacht stattgefunden und hoffentlich gut funktioniert. Unser SUFU befand sich nun wohl bitte in dem Plasmid drinnen. Daher mussten wir jetzt nur noch unsere Plasmide in Bakterien hineinbringen. Wie wir bereits wussten, nahmen wir dazu eine Flüssigkeit, in der jede Menge Bakterien wachsen können (mit Hefe versetzt). Unsere Plasmide wurden in Eppis gegeben und mit der Flüssigkeit zusammen gemischt. Die Bakterienwaren die wir dazu nahmen waren e-coli. Bei einem Heatshock von etwa 40° C in einem Wasserbad sollten die Bakterien das Plasmid in sich aufnehmen.

Als nächstes holten wir uns 4 verschiedene Nährplatten (mit Ampicillin) auf die wir die Bakterien unterm Gashahn wieder mit dem Drigalskispatel auftrugen. Kann man ganz schön lange kreisen, bis alles schön eingezogen ist. Vorher hatten wir die Platten noch ein wenig auf 37° C aufgewärmt. Naja das wars dann für den heutigen Tag eigentlich auch. Denn die Platten kamen dann über Nacht in den Inkubator, wo sich die Bakterien vermehren sollten und Kolonien bilden. Doch das war mal ganz ihnen überlassen ;-). Morgen sehen wir dann weiter und hoffen auf positive Klone.

Ansonsten gabs für uns nur noch eins zu tun: unsere Präsentation für morgen erstellen. Und das stellte sich als schwieriger heraus als gedacht. War gar nicht so einfach, noch alle Daten und Fakten der letzen 3 Wochen genau wiedergeben zu können. Denn diese unglaublich hohe Fülle an Wissen im Gedächtnis zu behalten erfordert schon einiges an Erinnerungsvermögen. Auch konnten wir einige neue Erkenntnisse erlangen und Fehler ausbessern. und Nach vielem Diskutieren und Zusammenarbeit hats dann aber doch noch ganz gut funktioniert und wir waren zufrieden. Das können wir morgen bestimmt präsentieren. Schaut ganz gut aus!

Jetzt neigt sich meine Arbeit an der Uni Salzburg schon schön langsam dem Ende zu. Der Abschluss liegt bereits in greifbarer Nähe, nun in der Mitte der letzten Woche. Heute Morgen haben wir dann auch mit unserem gestern angefangenen Klonierungsversuch weitergemacht. Dazu haben wir heute die Proben aus der PCR auf ein Gel aufgetragen und mit dem Skalpell ausgeschnitten. Diesmal durfte ich auch alleine mit dem Messer hantieren. War ja auch eine gut sichtbare große Bande. Danach wurde alles wieder eingeschmolzen und das Gel über eine Säule gereinigt. Dafür hatten wir ja ein Kit und wir hatten es vor einer Woche auch schon mal gemacht, deshalb gabs keine Probleme mehr. Die Proben wurden also gereinigt und danach am NanoDrop gemessen. Ergebnisse waren gut und daher konnte alles für die Ligation vorbereitet werden. Das heißt unsere Probe wurde mit Wasser, Enzym, Ligase und Buffer versetzt und danach in ein Wasserbad gestellt. Dort bleibt es jetzt über Nacht im Kühlraum.

Außerdem hatten wir heute auch noch neue Buffer für Wolfi hergestellt. Er ist momentan schließlich sehr beschäftigt mit seinen ganzen Western Blots und so konnten wir ihm etwas Arbeit abnehmen und sparen. Insgesamt machten wir 3 Buffer. 1 Blotho, 1 Elektrophoresebuffer und noch nen dritten - PBS.
Für die Buffer holten wir uns vorher alle möglichen Chemikalien unter den Abzug herüber. Diese mussten wir dann alle genau abmessen und in die einzelnen Flaschen einfüllen. Für Blotho 500 ml, die anderen beiden in 2L – Behälter. Dann wurden die verschiedenen Chemikalienmixes mit sterilem Wasser aufgefüllt. Zum umrühren wird ein kleiner Stab verwendet (liebevoll Fischi genannt) der auf einen Pult mit Magnetkraft gestellt wird. Die Bewegung des Fischi erledigt dann für uns sehr gut die Umrührarbeit. Beim Blotho haben wir dann auch noch den PH-Wert gemessen. Er sollte bei 7,5 liegen. Da er beim ersten Messen bei ca. 6,9 lag musste wir etwas NaOH hinzugeben um ihn nach oben zu korrigieren. Da dies nicht gerade einfach gelingt brauchten wir auch noch die Gegenkraft: HCL. Mit ihr kam der Wert wieder weiter nach unten. Am Ende lag das Ergebnis bei 7,494. Damit beließen wirs dann aber auch dabei. Ist eigentlich eh schon fast genau.

Unsere Zellen besuchten wir dann auch noch kurz und sahen, dass sie seit Montag bereits wieder ziemlich rapide gewachsenen waren (meine Flasche war natürlich schon etwas voller als Connys).
Am Nachmittag hatten wir dann Zeit, unsere Präsentation für morgen vorzubereiten. Naja… mal schaun was da dann so rauskommt. Bestimmt mal sehr interessant. Aber es war auf jeden Fall eine ziemlich gute Auffrischung der letzten Wochen. Denn die extreme Fülle an Informationen ist sehr leicht wieder vergessen.

Neuer Versuch – neues Glück. Wir lassen uns das Klonen einfach nicht nehmen. Nachdem wir in der ersten Woche ja an unserem Klonierungsprogramm gescheitert sind und keine sinnvollen Banden herausbekommen haben. Daher haben wir es gestern dann noch einmal versucht. Vielleicht schaffen wirs diesmal ja endlich auf positive Klone zu kommen. Der Vorgang war jetzt nicht sehr anders wie beim letzen mal. Nur einige Faktoren hatten wir umgetauscht. Unter anderem wollten wir die Enden nicht cippen. Außerdem nahmen wir auch ein anderes Restriktionsenzym. Statt BamH1 nahmen wir BamH1 HF. Und unser eigentlicher Plan wäre auch noch gewesen, die Proben nicht über ein Gel zu reinigen sondern nur über eine Säule. Allerdings sahen wir auf dem Gel dann ziemlich starke Supercoils und entschieden uns doch für ein Ausschneiden aus dem Gel. Also machten wir dann alles sonst so wie vor einer Woche. Die Arbeitsschritte kannten wir ja bereits und so war es nicht sonderlich schwer. An diesem Tag kamen wir dann genau so weit, dass wir noch fertig über die Säule reinigten (wieder mit dem zugehörigen Kit). Dabei blieben uns noch 50 % der DNA übrig. D.h. 2,5 µg.

Nachdem wir hier fertig waren, durften wir Wolfi bei seiner RT-PCR zusehen. Dafür verwendete er Proben von sich und Markus. Ausgangsstoff hierfür ist cDNA (die hatten wir ja schon zuvor hergestellt). Die Arbeit war sehr spannend zu beobachten. Allerdings ist sie auch äußerst genau und kompliziert. Allein die Mini mini min Eppis in die die Probe kommen sollten sehen klein genug aus um jede Menge Fehler zu machen  Aber Wolfi machte es natürlich gut. Er nahm die Samples aus dem Kühlschrank, legte Wasser vor und mischte nebenbei einen Mix aus Primer und Cybergreen (Farbstoff, der in doppelsträngige DNA interkaliert. Seine Samples gab er dann hinzu zum Wasser um sie zu verdünnen. In einem Reck mit 72 Löchern (darin passen genau die Mini Eppis) gab er dann die erfordeten 40 Eppis in die Positionen 1-40. Dabei nahm er jeweils 5 µl Primer/Cybergreen und 5 µl H2O/Samples. Es war nämlich so, dass er zwar nur 20 verschiedene Samples hatte, für jedes Sampel allerdings auch noch ein technisches Duplikat erstellen wollte. Daher die 40 verschiedenen Eppis. In der RT-PCR laufen die Samples dann für 1 ½ Stunden. An den Farbbanden kann man dann genau die Länge der Banden herauslesen. Die Farbtabelle ist auch am Computerprogramm zu sehen. Das Ergebnis der PCR konnten wir allerdings nicht mehr abwarten.

Zu unserer Überraschung bekamen wir auch noch die Aufgabe, eine Präsentation über unsere Arbeit in den letzen 3 Wochen zu erstellen um sie vor der gruppe zu präsentieren. Also deshalb, geht’s dann ab morgen auch gleich an die Zusammenstellung! So schwer wird’s ja hoffentlich schon nicht sein.

Montag, Montag. Der letzte Montag meines Praktikums. Die Zeit vergeht einfach viel zu schnell und bald ists schon wieder vorbei…

Sohoo nun waren wir also bei der cDNA Synthese angekommen. Die RNA wollten wir in cDNA umwandeln weil diese resistenter und weniger anfällig für Verunreinigungen ist. RNAsen, der größte Feind unserer RNA ist in der Umwelt häufig vorhanden – viel häufiger als die für die DNA schädlichen DNAsen. Für unser PCR Programm wollten wir also jetzt DNA, cDNa um genau zu sein. Das machten wir so:
Von unserer RNA nahmen wir 2 -4 µl und gaben sie in neue Eppis. Den genauen Betrag hatten wir uns vorher errechnet. Es kam ganz auf die Konzentration der RNA an. Den Rest füllten wir mit Wasser auf um auf ein Gesamtvolumen von 18,5 µl zu kommen. Außerdem kam in unsere 7 Eppis auch noch jeweils 1 µl oligo dT23AGC primer hinzu. Das alles kam in die PCR (Name: SEXY1) und blieb dort für 7 Minuten bei 68° C.
Unseren vorher vorbereiteten Enzymmix gaben wir danach hinzu. Er bestand aus: 6 µl 5x buffer, 3 µl 0,1M DTT, 1 µl dNTPs (Nukleotide) und 0,5 µl Superscript. Zusammen machten wir einen Mastermix für gleich all unsere Eppis. Die PCR kühlte vorher aber noch auf 25° C herab. (Im Programm machte man hier einfach eine Pause eben für diese Enzymbeigabe. Nun lief das Programm noch für weitere 80 min bei 42° C. Wir machten in der Zwischenzeit mal Mittagspause.
Für die Hydrolyse gaben wir nachher noch 10 µl 0,1 M NaOH hinzu und noch mal gings für 10 min und 70° C in die PCR. Für die Neutralisation zu NaCl gaben wir dann noch weitere 10 µl 0,1M HCl hinzu und genau so beließen wir unsere Eppis. Für weitere Verwendung waren sie nun geeignet.

Aber gehen wir doch zwischendurch mal ganz woanders hin. Nämlich in die Zellkultur und zu unseren schönen Hautzellen. Die wurden gestern mal gespalten. Es wurde ihnen schließlich in dem kleinen Fläschchen schon etwas eng und wir wollten wieder Platz zum weiter ausbreiten schaffen. Dabei half uns Markus. Er sagte uns wie wir das alte Medium absaugen mussten, dann in die Flaschen ein wenig BBS damit sich die Zellen vom Boden lösen – man sah unterm Mikroskop und sogar mit freiem Auge wie sich so schleimige Klumpen lösten und herumschwammen. Als alles unten war konnten dann ein Enzym (3,5 ml) und das neue Medium hinzugefügt werden. Dazu wurde mit der Pipette alles ein wenig auf und ab pipettiert um alles schön zu vermischen. Meine Zellen sind nun in einem Verhältnis von 3:5 in der neuen Flasche und Connys 1:5. Meine sollte also schneller wieder voll bewachsen sein. Mal sehen, was die nächsten Tage so bringen. Bin schon mal gespannt.

Ok jetzt bin ich hier noch die Messergebnisse unserer freitägigen RNA Isolation schuldig. Nachdem wir eben die Eppis mit (hoffentlich) dem RNA-Inhalt einige Male mit Ethanol versetzt, wieder gereinigt, abpipettiert und zentrifugiert haben, kam nun am NanoDrop die Stunde der Wahrheit. Denn schließlich gab es unzählige Augenblicke und Gelegenheiten wo wir unsre RNA verlieren können hätten. Davon abgesehen, dass wir von Anfang an mit beinahe unsichtbarem Material arbeiteten.

Also auf auf gings mit den Eppis zum Nanodrop. Den konnten wir auch mittlerweile schon bedienen und benutzen. Und die Messergebnisse waren auch wirklich sehr erfreulich:

Name RNA-Gehalt Reinheit 260/280
Xeno shc002 677,8 ng/µl 1,94
Xeno shstat3 80,2 ng/µl 1,78
ASZ shstat3 582,2 ng/µl 1,95
ASZ cxcs4 590 530,3 ng/µl 1,94
ASZ shcool WG 624,2 ng/µl 1,95
ASZ 584 607,2 ng/µl 1,94
ASZ shcool ME 102,4 ng/µl 1,99

Bis auf das Xeno shstat3 hatten alle genügend RNA enthalten um sie danach problemlos in cDNA umschreiben zu können. Und auch bei der Reinheit waren wir vollkommen zufrieden. Ein Wert zwischen 1,7 und 2 war gerade optimal. Ein super Ergebnis also. Und ja juhuuu wir hatten nicht ein RNA-Pellet verloren! Was für ein Erfolg. Es konnte also weitergehen.

So ich hab hier noch den Rest von letzter Woche vorenthalten. Es fehlen vor allem noch die Beschreibungen über die RNA-Isolation. Mit ihr haben wir am Donnerstag begonnen. Da wir in dieser Woche eine Real Time PCR fahren sollten, musste vorher die RNA aus den Zelllinien der Proteine von Wolfi isoliert werden und in cDNA umgewandelt werden. Doch alles der Reihe nach. Die Arbeit erledigten wir zusammen mit Helene.

1. Wir nahmen also Wolfis RNA Eppis und gaben 1 ml TRI dazu und stellten die Eppis nun für etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur zur Seite.

2. Jetzt kommen 200 µl Chloroform hinzu und die Eppis werden gut gevortext. Danach werden sie für etwa 2-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zentrifugiert werden sie auch noch bei 4° C für 15 Minuten.

3. Die Eppis werden nun auch noch mit 500µl Isopropanol versetzt. Doch diesmal werden die Eppis nicht gevortex sondern nur ein wenig gekippt und leicht geschwenkt. Denn das vortexen würde die RNA zerstören. Danach werden sie wie zuvor etwa 10-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und danach für 8 Minuten bei 4° C zentrifugiert. Es sollte hierbei als Ergebnis ein schönes Farbspiel rauskommen. Es waren die Eppis vorher schon in tollem pinken Medium doch nun sollten sich die Stoffe auftrennen. Das Chloroform bewirk, dass die obere Hälfte – die die RNA enthält - durchsichtig ist und in der Mitte trennt eine dünne Schicht die untere pinke Flüssigkeit mit den unnötigen Verunreinigungen wie DNA und Proteinen. Ganz vorsichtig wird die durchsichtige Flüssigkeit dann abgehoben und man muss vor allem aufpassen, nichts vom Schleim oder der pinken Flüssigkeit hinein zu bekommen.

4. Nun wird die RNA gewaschen: Dazu wird der abpipettierte Überstand in frische Eppis gefüllt. In ihnen sollte ein ganz ganz kleines Pellet zu sehen sein, dass die RNA enthält. Es ist allerdings kaum sichtbar und daher sind die folgenden Schritte auch besonders schwer und mit Vorsicht durchzuführen. Der nächste besteht darin, 1 ml 75 %igen Ethanol in die Eppis hinzuzugeben und bei 4° C zu zentrifugieren. Der Ethanolüberstand wird wieder abpipettiert. Um das Pellet möglichst nicht mit herauszunehmen (dann wäre die ganze RNA verloren) sollte man sich merken wie die Eppis in der Zentrifuge platziert waren und wo sich somit das Pellet befinden sollte. So kann man es im Eppi belassen und nur den Ethanol wegbringen. Dann wird der restliche Ethanol abgespinnt und einfach bei Raumtemperatur getrocknet. (Ethanol hat einen sehr geringen Siedepunkt und verdampft daher sehr rasch)

5. Nun werden die RNA-Pellets in 100mM Hepes/6M Urea gesammelt. Zu diesem Volumen gibt man dann auch noch die Hälfte des Volumens von 9M LiCl (Lithiumchlorid) hinzu -> 50µl Hepes/Urea, 25µl LiCl. Das war für uns am Donnerstag dann auch erst mal der letzte Schritt. Die Eppis kamen schön über Nacht bei 4° C in den Kühlschrank und blieben bis zu weiteren Schritten am nächsten Tag dort drinnen.

6. Neuer Tag – Freitag Vormittag. Und schon geht’s wieder weiter mit unserer RNA-Isolation. Netterweise hatte Helene bereits unsere Eppis in die Zentrifuge gestellt und bei 4° C eingestellt. Der Überstand wird wieder heraus pipettiert, ohne die Pellets zu entfernen. Der Blick ist mittlerweile auch schon etwas geschärfter und die Pellets sichtbar. Die Größen sind jedoch unterschiedlich groß. Wieder kommt 1ml Ethanol hinzu (gleich wie gestern 75%iger), zentrifugiert bei 4° C für 5 Min und der Überstand dann wieder abpipettiert. Das ganze wird 1x wiederholt und danach spinnt man den übrigen Ethanol ab und trocknet alles an der Luft bis das Pellet allein übrig bleibt. Der Rest wird mit Wasser im Eppi aufgefüllt. Dabei sind die Mengen nicht identisch sondern halten sich an die Größe der Pellets. Die Mengen gehen auseinander von 22µl bis 30 µl.

Weil der Arbeitstag fürs erste vorbei war, gings mit den Eppis aufs Eis, in dem sie übers Wochenende bleiben sollte. Dort fühlen sie sich genau wohl. Gut wenn sis bis zum Montag schaffen. Gut nun hatten wir auch noch unsere Zellen um die wir uns kümmern mussten. Denn die hatten ihr Nährmedium bereits fast verspeist und brauchten einen Wechsel. Das erledigten wir unter Markus‘ Aufsicht auch anstandslos. Nun war die Flüssigkeit in unseren Fläschchen wieder schön tiefrot und die Hautzellen sollten bis zum Montag wohl hoffentlich nicht verhungern. Zurück im Inkubator (37° C) verließen wir unsere Schützlinge dann auch; Zuversichtlich dass sie gut versorgt waren. Am Montag geht’s ans spalten um ihnen wieder mehr Platz zu lassen, denn vermehren tun sie sich unheimlich schnell.

So – spät aber doch. Um mal den gestrigen Tag hier endlich zu protokollieren.

Gestern hatten wir dann so mehr oder weniger die Lösung unseres Klonierungsproblems herausgefunden. Es waren nämlich die Puro- und Neovektoren vertauscht und somit waren keine Ergebnisse auf dem Gel sichtbar.
Wir hatten dann gestern also noch einmal eine Colony-PCR gefahren und die verschiedensten Proben auf unser Agarose-Gel aufgetragen. (Also darin sind Conny und ich mittlerweile ja schon richtig gut – ich möchte nicht sagen fast schon routiniert ;-) Helene hatte für diesen Versuch jetzt einfach die beiden Primermix vertauscht. Puro für Neo und Neo für Puro. Danach warteten wir gespannt auf das Ergebnis …
Auf dem Gel war dann bei Puro auch tatsächlich eine Bande vorhanden. Allerdings bei Neo schon wieder nicht. Die Primer mussten also Probleme machen. Um noch einmal kurz anzuführen: Puro und Neo brauchen jeweils einen „forward primer“ und einen „reverse primer“. Dabei haben sie denselben fp und aber zwei verschiedene rp.

Aus diesem Grund gings dann auch gleich unverzüglich auf zum nächsten Versuch. Eine neue PCR musste sogleich her. Diesmal allerdings mischten wir einfach alle 3 Primer zusammen und erstellten einen Mastermix. Eben mit den 2 rp und dem 1 fp für Neo und Puro.

Der Mastermix bestand aus: 2x 106,5 µl Gotaq
17 µl Primer
.. für jedes Eppi.

Wie bereits gewohnt (und gekonnt) pickten wir dann aus unserer Masterplate wiederum Teile unserer 16 verschiedener Klone und gaben sie wie gewohnt in 200 µl Wasser. Alles schön zusammenpipettiert wanderten die Proben dann auch unverzüglich wieder in die PCR-Maschine und blieben dort für die nächsten 2 Stunden. (Programm wurde dasselbe wie in den letzten Versuchen gefahren)

Da wir genug Zeit übrig hatten gingen wir unsere Zellen besuchen. Diese hatten sich bisher schon sehr gut entwickelt und vermehrten sich ganz ungeniert. Unter dem Mikroskop war der Freiraum schon sehr knapp geworden und der Platz in den Flaschen wurde zusehends spärlicher. Um die genaue Entwicklung unserer Schützlinge zu dokumentieren haben wir sie abfotografiert und gespeichert. Am Ende können wir dann hoffentlich auch eine zufriedenstellende Bilderchronologie zurückblicken. Na aber sie machen sich super und dieser Besuch in der Zellkultur hatte sich definitiv gelohnt.

Am Nachmittag hatten wir dann das Vergnügen, Wolfi bei der Erstellung eines Western Blots zuzusehen. Seine Proteine vom vorherigen Tag wollte er auf ein Gel auftragen. Naja wir kannten zwar bereits unser einfaches Agarosegel für die Gelelektrophorese, nur sein Gebilde sah eindeutig komplizierter aus. Es bestand aus insgesamt 4 Glasplatten (2 für jeweils einen Versuch – immer Duplikate von einer Probe) und dazwischen einem Acrylamidgel. Darauf sollten die Proteine hinauf pipettiert werden. Vorher wurden die Proteine jedoch noch bei 95° für 5 min denaturiert. In der Elektrophoresekammer wurde dann auch noch der Strom aufgelegt und die Proben konnten nach haarfeinem und genauem Einfügen in die Slots schön in Richtung Anode nach unten fließen. 2 x musste dieselbe Arbeit von Wolfi getan werden. Jede Seite sollte die gleichen Proben enthalten.

Über Mittag lief der Strom dann auch und am Nachmittag konnten die fertige Gele in einem „Sandwich“ verpackt werden. Dafür benötigte man einen Klappbehälter für den Halt, zwei Schwämme (pro Gel), zugeschnittenes Papier und natürlich die spezifische Membran. Alles wurde zusammengelegt, das Gel schön vorsichtig vom Glas getrennt und danach in den Buffers Betamercaptoethanol gegeben. Die Proteine sollten sich dabei auf die Membran übertragen. Alles wurde mit 250 mA Stromstärke (I) angeschlossen.

Es war also wieder einmal ein sehr abwechslungsreicher und interessanter Tag. Mal sehen, wies mit den Klonen und Wolfis Western Blot weitergeht. Und dann gibt’s da ja auch noch unsere Hautzellen, die wir nicht vergessen wollen. Für die nächsten Tage geht uns die Arbeit also ganz bestimmt nicht aus!

So – spät aber doch. Um mal den gestrigen Tag hier endlich zu protokollieren.

Gestern hatten wir dann so mehr oder weniger die Lösung unseres Klonierungsproblems herausgefunden. Es waren nämlich die Puro- und Neovektoren vertauscht und somit waren keine Ergebnisse auf dem Gel sichtbar.
Wir hatten dann gestern also noch einmal eine Colony-PCR gefahren und die verschiedensten Proben auf unser Agarose-Gel aufgetragen. (Also darin sind Conny und ich mittlerweile ja schon richtig gut – ich möchte nicht sagen fast schon routiniert ;-) Helene hatte für diesen Versuch jetzt einfach die beiden Primermix vertauscht. Puro für Neo und Neo für Puro. Danach warteten wir gespannt auf das Ergebnis …
Auf dem Gel war dann bei Puro auch tatsächlich eine Bande vorhanden. Allerdings bei Neo schon wieder nicht. Die Primer mussten also Probleme machen. Um noch einmal kurz anzuführen: Puro und Neo brauchen jeweils einen „forward primer“ und einen „reverse primer“. Dabei haben sie denselben fp und aber zwei verschiedene rp.

Aus diesem Grund gings dann auch gleich unverzüglich auf zum nächsten Versuch. Eine neue PCR musste sogleich her. Diesmal allerdings mischten wir einfach alle 3 Primer zusammen und erstellten einen Mastermix. Eben mit den 2 rp und dem 1 fp für Neo und Puro.

Der Mastermix bestand aus: 2x 106,5 µl Gotaq
17 µl Primer
.. für jedes Eppi.

Wie bereits gewohnt (und gekonnt) pickten wir dann aus unserer Masterplate wiederum Teile unserer 16 verschiedener Klone und gaben sie wie gewohnt in 200 µl Wasser. Alles schön zusammenpipettiert wanderten die Proben dann auch unverzüglich wieder in die PCR-Maschine und blieben dort für die nächsten 2 Stunden. (Programm wurde dasselbe wie in den letzten Versuchen gefahren)

Da wir genug Zeit übrig hatten gingen wir unsere Zellen besuchen. Diese hatten sich bisher schon sehr gut entwickelt und vermehrten sich ganz ungeniert. Unter dem Mikroskop war der Freiraum schon sehr knapp geworden und der Platz in den Flaschen wurde zusehends spärlicher. Um die genaue Entwicklung unserer Schützlinge zu dokumentieren haben wir sie abfotografiert und gespeichert. Am Ende können wir dann hoffentlich auch eine zufriedenstellende Bilderchronologie zurückblicken. Na aber sie machen sich super und dieser Besuch in der Zellkultur hatte sich definitiv gelohnt.

Am Nachmittag hatten wir dann das Vergnügen, Wolfi bei der Erstellung eines Western Blots zuzusehen. Seine Proteine vom vorherigen Tag wollte er auf ein Gel auftragen. Naja wir kannten zwar bereits unser einfaches Agarosegel für die Gelelektrophorese, nur sein Gebilde sah eindeutig komplizierter aus. Es bestand aus insgesamt 4 Glasplatten (2 für jeweils einen Versuch – immer Duplikate von einer Probe) und dazwischen einem Acrylamidgel. Darauf sollten die Proteine hinauf pipettiert werden. Vorher wurden die Proteine jedoch noch bei 95° für 5 min denaturiert. In der Elektrophoresekammer wurde dann auch noch der Strom aufgelegt und die Proben konnten nach haarfeinem und genauem Einfügen in die Slots schön in Richtung Anode nach unten fließen. 2 x musste dieselbe Arbeit von Wolfi getan werden. Jede Seite sollte die gleichen Proben enthalten.

Über Mittag lief der Strom dann auch und am Nachmittag konnten die fertige Gele in einem „Sandwich“ verpackt werden. Dafür benötigte man einen Klappbehälter für den Halt, zwei Schwämme (pro Gel), zugeschnittenes Papier und natürlich die spezifische Membran. Alles wurde zusammengelegt, das Gel schön vorsichtig vom Glas getrennt und danach in den Buffers Betamercaptoethanol gegeben. Die Proteine sollten sich dabei auf die Membran übertragen. Alles wurde mit 250 mA Stromstärke (I) angeschlossen.

Es war also wieder einmal ein sehr abwechslungsreicher und interessanter Tag. Mal sehen, wies mit den Klonen und Wolfis Western Blot weitergeht. Und dann gibt’s da ja auch noch unsere Hautzellen, die wir nicht vergessen wollen. Für die nächsten Tage geht uns die Arbeit also ganz bestimmt nicht aus!