Tag 9 - Zusehen und lernen
23:57 / 22.07.2010
So – spät aber doch. Um mal den gestrigen Tag hier endlich zu protokollieren.
Gestern hatten wir dann so mehr oder weniger die Lösung unseres Klonierungsproblems herausgefunden. Es waren nämlich die Puro- und Neovektoren vertauscht und somit waren keine Ergebnisse auf dem Gel sichtbar.
Wir hatten dann gestern also noch einmal eine Colony-PCR gefahren und die verschiedensten Proben auf unser Agarose-Gel aufgetragen. (Also darin sind Conny und ich mittlerweile ja schon richtig gut – ich möchte nicht sagen fast schon routiniert ;-) Helene hatte für diesen Versuch jetzt einfach die beiden Primermix vertauscht. Puro für Neo und Neo für Puro. Danach warteten wir gespannt auf das Ergebnis …
Auf dem Gel war dann bei Puro auch tatsächlich eine Bande vorhanden. Allerdings bei Neo schon wieder nicht. Die Primer mussten also Probleme machen. Um noch einmal kurz anzuführen: Puro und Neo brauchen jeweils einen „forward primer“ und einen „reverse primer“. Dabei haben sie denselben fp und aber zwei verschiedene rp.
Aus diesem Grund gings dann auch gleich unverzüglich auf zum nächsten Versuch. Eine neue PCR musste sogleich her. Diesmal allerdings mischten wir einfach alle 3 Primer zusammen und erstellten einen Mastermix. Eben mit den 2 rp und dem 1 fp für Neo und Puro.
Der Mastermix bestand aus: 2x 106,5 µl Gotaq
17 µl Primer
.. für jedes Eppi.
Wie bereits gewohnt (und gekonnt) pickten wir dann aus unserer Masterplate wiederum Teile unserer 16 verschiedener Klone und gaben sie wie gewohnt in 200 µl Wasser. Alles schön zusammenpipettiert wanderten die Proben dann auch unverzüglich wieder in die PCR-Maschine und blieben dort für die nächsten 2 Stunden. (Programm wurde dasselbe wie in den letzten Versuchen gefahren)
Da wir genug Zeit übrig hatten gingen wir unsere Zellen besuchen. Diese hatten sich bisher schon sehr gut entwickelt und vermehrten sich ganz ungeniert. Unter dem Mikroskop war der Freiraum schon sehr knapp geworden und der Platz in den Flaschen wurde zusehends spärlicher. Um die genaue Entwicklung unserer Schützlinge zu dokumentieren haben wir sie abfotografiert und gespeichert. Am Ende können wir dann hoffentlich auch eine zufriedenstellende Bilderchronologie zurückblicken. Na aber sie machen sich super und dieser Besuch in der Zellkultur hatte sich definitiv gelohnt.
Am Nachmittag hatten wir dann das Vergnügen, Wolfi bei der Erstellung eines Western Blots zuzusehen. Seine Proteine vom vorherigen Tag wollte er auf ein Gel auftragen. Naja wir kannten zwar bereits unser einfaches Agarosegel für die Gelelektrophorese, nur sein Gebilde sah eindeutig komplizierter aus. Es bestand aus insgesamt 4 Glasplatten (2 für jeweils einen Versuch – immer Duplikate von einer Probe) und dazwischen einem Acrylamidgel. Darauf sollten die Proteine hinauf pipettiert werden. Vorher wurden die Proteine jedoch noch bei 95° für 5 min denaturiert. In der Elektrophoresekammer wurde dann auch noch der Strom aufgelegt und die Proben konnten nach haarfeinem und genauem Einfügen in die Slots schön in Richtung Anode nach unten fließen. 2 x musste dieselbe Arbeit von Wolfi getan werden. Jede Seite sollte die gleichen Proben enthalten.
Über Mittag lief der Strom dann auch und am Nachmittag konnten die fertige Gele in einem „Sandwich“ verpackt werden. Dafür benötigte man einen Klappbehälter für den Halt, zwei Schwämme (pro Gel), zugeschnittenes Papier und natürlich die spezifische Membran. Alles wurde zusammengelegt, das Gel schön vorsichtig vom Glas getrennt und danach in den Buffers Betamercaptoethanol gegeben. Die Proteine sollten sich dabei auf die Membran übertragen. Alles wurde mit 250 mA Stromstärke (I) angeschlossen.
Es war also wieder einmal ein sehr abwechslungsreicher und interessanter Tag. Mal sehen, wies mit den Klonen und Wolfis Western Blot weitergeht. Und dann gibt’s da ja auch noch unsere Hautzellen, die wir nicht vergessen wollen. Für die nächsten Tage geht uns die Arbeit also ganz bestimmt nicht aus!
Gestern hatten wir dann so mehr oder weniger die Lösung unseres Klonierungsproblems herausgefunden. Es waren nämlich die Puro- und Neovektoren vertauscht und somit waren keine Ergebnisse auf dem Gel sichtbar.
Wir hatten dann gestern also noch einmal eine Colony-PCR gefahren und die verschiedensten Proben auf unser Agarose-Gel aufgetragen. (Also darin sind Conny und ich mittlerweile ja schon richtig gut – ich möchte nicht sagen fast schon routiniert ;-) Helene hatte für diesen Versuch jetzt einfach die beiden Primermix vertauscht. Puro für Neo und Neo für Puro. Danach warteten wir gespannt auf das Ergebnis …
Auf dem Gel war dann bei Puro auch tatsächlich eine Bande vorhanden. Allerdings bei Neo schon wieder nicht. Die Primer mussten also Probleme machen. Um noch einmal kurz anzuführen: Puro und Neo brauchen jeweils einen „forward primer“ und einen „reverse primer“. Dabei haben sie denselben fp und aber zwei verschiedene rp.
Aus diesem Grund gings dann auch gleich unverzüglich auf zum nächsten Versuch. Eine neue PCR musste sogleich her. Diesmal allerdings mischten wir einfach alle 3 Primer zusammen und erstellten einen Mastermix. Eben mit den 2 rp und dem 1 fp für Neo und Puro.
Der Mastermix bestand aus: 2x 106,5 µl Gotaq
17 µl Primer
.. für jedes Eppi.
Wie bereits gewohnt (und gekonnt) pickten wir dann aus unserer Masterplate wiederum Teile unserer 16 verschiedener Klone und gaben sie wie gewohnt in 200 µl Wasser. Alles schön zusammenpipettiert wanderten die Proben dann auch unverzüglich wieder in die PCR-Maschine und blieben dort für die nächsten 2 Stunden. (Programm wurde dasselbe wie in den letzten Versuchen gefahren)
Da wir genug Zeit übrig hatten gingen wir unsere Zellen besuchen. Diese hatten sich bisher schon sehr gut entwickelt und vermehrten sich ganz ungeniert. Unter dem Mikroskop war der Freiraum schon sehr knapp geworden und der Platz in den Flaschen wurde zusehends spärlicher. Um die genaue Entwicklung unserer Schützlinge zu dokumentieren haben wir sie abfotografiert und gespeichert. Am Ende können wir dann hoffentlich auch eine zufriedenstellende Bilderchronologie zurückblicken. Na aber sie machen sich super und dieser Besuch in der Zellkultur hatte sich definitiv gelohnt.
Am Nachmittag hatten wir dann das Vergnügen, Wolfi bei der Erstellung eines Western Blots zuzusehen. Seine Proteine vom vorherigen Tag wollte er auf ein Gel auftragen. Naja wir kannten zwar bereits unser einfaches Agarosegel für die Gelelektrophorese, nur sein Gebilde sah eindeutig komplizierter aus. Es bestand aus insgesamt 4 Glasplatten (2 für jeweils einen Versuch – immer Duplikate von einer Probe) und dazwischen einem Acrylamidgel. Darauf sollten die Proteine hinauf pipettiert werden. Vorher wurden die Proteine jedoch noch bei 95° für 5 min denaturiert. In der Elektrophoresekammer wurde dann auch noch der Strom aufgelegt und die Proben konnten nach haarfeinem und genauem Einfügen in die Slots schön in Richtung Anode nach unten fließen. 2 x musste dieselbe Arbeit von Wolfi getan werden. Jede Seite sollte die gleichen Proben enthalten.
Über Mittag lief der Strom dann auch und am Nachmittag konnten die fertige Gele in einem „Sandwich“ verpackt werden. Dafür benötigte man einen Klappbehälter für den Halt, zwei Schwämme (pro Gel), zugeschnittenes Papier und natürlich die spezifische Membran. Alles wurde zusammengelegt, das Gel schön vorsichtig vom Glas getrennt und danach in den Buffers Betamercaptoethanol gegeben. Die Proteine sollten sich dabei auf die Membran übertragen. Alles wurde mit 250 mA Stromstärke (I) angeschlossen.
Es war also wieder einmal ein sehr abwechslungsreicher und interessanter Tag. Mal sehen, wies mit den Klonen und Wolfis Western Blot weitergeht. Und dann gibt’s da ja auch noch unsere Hautzellen, die wir nicht vergessen wollen. Für die nächsten Tage geht uns die Arbeit also ganz bestimmt nicht aus!
