Noch zu Tag 9 und 10 - RNA und Zellen sind um uns
20:21 / 26.07.2010
So ich hab hier noch den Rest von letzter Woche vorenthalten. Es fehlen vor allem noch die Beschreibungen über die RNA-Isolation. Mit ihr haben wir am Donnerstag begonnen. Da wir in dieser Woche eine Real Time PCR fahren sollten, musste vorher die RNA aus den Zelllinien der Proteine von Wolfi isoliert werden und in cDNA umgewandelt werden. Doch alles der Reihe nach. Die Arbeit erledigten wir zusammen mit Helene.
1. Wir nahmen also Wolfis RNA Eppis und gaben 1 ml TRI dazu und stellten die Eppis nun für etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur zur Seite.
2. Jetzt kommen 200 µl Chloroform hinzu und die Eppis werden gut gevortext. Danach werden sie für etwa 2-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zentrifugiert werden sie auch noch bei 4° C für 15 Minuten.
3. Die Eppis werden nun auch noch mit 500µl Isopropanol versetzt. Doch diesmal werden die Eppis nicht gevortex sondern nur ein wenig gekippt und leicht geschwenkt. Denn das vortexen würde die RNA zerstören. Danach werden sie wie zuvor etwa 10-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und danach für 8 Minuten bei 4° C zentrifugiert. Es sollte hierbei als Ergebnis ein schönes Farbspiel rauskommen. Es waren die Eppis vorher schon in tollem pinken Medium doch nun sollten sich die Stoffe auftrennen. Das Chloroform bewirk, dass die obere Hälfte – die die RNA enthält - durchsichtig ist und in der Mitte trennt eine dünne Schicht die untere pinke Flüssigkeit mit den unnötigen Verunreinigungen wie DNA und Proteinen. Ganz vorsichtig wird die durchsichtige Flüssigkeit dann abgehoben und man muss vor allem aufpassen, nichts vom Schleim oder der pinken Flüssigkeit hinein zu bekommen.
4. Nun wird die RNA gewaschen: Dazu wird der abpipettierte Überstand in frische Eppis gefüllt. In ihnen sollte ein ganz ganz kleines Pellet zu sehen sein, dass die RNA enthält. Es ist allerdings kaum sichtbar und daher sind die folgenden Schritte auch besonders schwer und mit Vorsicht durchzuführen. Der nächste besteht darin, 1 ml 75 %igen Ethanol in die Eppis hinzuzugeben und bei 4° C zu zentrifugieren. Der Ethanolüberstand wird wieder abpipettiert. Um das Pellet möglichst nicht mit herauszunehmen (dann wäre die ganze RNA verloren) sollte man sich merken wie die Eppis in der Zentrifuge platziert waren und wo sich somit das Pellet befinden sollte. So kann man es im Eppi belassen und nur den Ethanol wegbringen. Dann wird der restliche Ethanol abgespinnt und einfach bei Raumtemperatur getrocknet. (Ethanol hat einen sehr geringen Siedepunkt und verdampft daher sehr rasch)
5. Nun werden die RNA-Pellets in 100mM Hepes/6M Urea gesammelt. Zu diesem Volumen gibt man dann auch noch die Hälfte des Volumens von 9M LiCl (Lithiumchlorid) hinzu -> 50µl Hepes/Urea, 25µl LiCl. Das war für uns am Donnerstag dann auch erst mal der letzte Schritt. Die Eppis kamen schön über Nacht bei 4° C in den Kühlschrank und blieben bis zu weiteren Schritten am nächsten Tag dort drinnen.
6. Neuer Tag – Freitag Vormittag. Und schon geht’s wieder weiter mit unserer RNA-Isolation. Netterweise hatte Helene bereits unsere Eppis in die Zentrifuge gestellt und bei 4° C eingestellt. Der Überstand wird wieder heraus pipettiert, ohne die Pellets zu entfernen. Der Blick ist mittlerweile auch schon etwas geschärfter und die Pellets sichtbar. Die Größen sind jedoch unterschiedlich groß. Wieder kommt 1ml Ethanol hinzu (gleich wie gestern 75%iger), zentrifugiert bei 4° C für 5 Min und der Überstand dann wieder abpipettiert. Das ganze wird 1x wiederholt und danach spinnt man den übrigen Ethanol ab und trocknet alles an der Luft bis das Pellet allein übrig bleibt. Der Rest wird mit Wasser im Eppi aufgefüllt. Dabei sind die Mengen nicht identisch sondern halten sich an die Größe der Pellets. Die Mengen gehen auseinander von 22µl bis 30 µl.
Weil der Arbeitstag fürs erste vorbei war, gings mit den Eppis aufs Eis, in dem sie übers Wochenende bleiben sollte. Dort fühlen sie sich genau wohl. Gut wenn sis bis zum Montag schaffen. Gut nun hatten wir auch noch unsere Zellen um die wir uns kümmern mussten. Denn die hatten ihr Nährmedium bereits fast verspeist und brauchten einen Wechsel. Das erledigten wir unter Markus‘ Aufsicht auch anstandslos. Nun war die Flüssigkeit in unseren Fläschchen wieder schön tiefrot und die Hautzellen sollten bis zum Montag wohl hoffentlich nicht verhungern. Zurück im Inkubator (37° C) verließen wir unsere Schützlinge dann auch; Zuversichtlich dass sie gut versorgt waren. Am Montag geht’s ans spalten um ihnen wieder mehr Platz zu lassen, denn vermehren tun sie sich unheimlich schnell.
1. Wir nahmen also Wolfis RNA Eppis und gaben 1 ml TRI dazu und stellten die Eppis nun für etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur zur Seite.
2. Jetzt kommen 200 µl Chloroform hinzu und die Eppis werden gut gevortext. Danach werden sie für etwa 2-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zentrifugiert werden sie auch noch bei 4° C für 15 Minuten.
3. Die Eppis werden nun auch noch mit 500µl Isopropanol versetzt. Doch diesmal werden die Eppis nicht gevortex sondern nur ein wenig gekippt und leicht geschwenkt. Denn das vortexen würde die RNA zerstören. Danach werden sie wie zuvor etwa 10-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und danach für 8 Minuten bei 4° C zentrifugiert. Es sollte hierbei als Ergebnis ein schönes Farbspiel rauskommen. Es waren die Eppis vorher schon in tollem pinken Medium doch nun sollten sich die Stoffe auftrennen. Das Chloroform bewirk, dass die obere Hälfte – die die RNA enthält - durchsichtig ist und in der Mitte trennt eine dünne Schicht die untere pinke Flüssigkeit mit den unnötigen Verunreinigungen wie DNA und Proteinen. Ganz vorsichtig wird die durchsichtige Flüssigkeit dann abgehoben und man muss vor allem aufpassen, nichts vom Schleim oder der pinken Flüssigkeit hinein zu bekommen.
4. Nun wird die RNA gewaschen: Dazu wird der abpipettierte Überstand in frische Eppis gefüllt. In ihnen sollte ein ganz ganz kleines Pellet zu sehen sein, dass die RNA enthält. Es ist allerdings kaum sichtbar und daher sind die folgenden Schritte auch besonders schwer und mit Vorsicht durchzuführen. Der nächste besteht darin, 1 ml 75 %igen Ethanol in die Eppis hinzuzugeben und bei 4° C zu zentrifugieren. Der Ethanolüberstand wird wieder abpipettiert. Um das Pellet möglichst nicht mit herauszunehmen (dann wäre die ganze RNA verloren) sollte man sich merken wie die Eppis in der Zentrifuge platziert waren und wo sich somit das Pellet befinden sollte. So kann man es im Eppi belassen und nur den Ethanol wegbringen. Dann wird der restliche Ethanol abgespinnt und einfach bei Raumtemperatur getrocknet. (Ethanol hat einen sehr geringen Siedepunkt und verdampft daher sehr rasch)
5. Nun werden die RNA-Pellets in 100mM Hepes/6M Urea gesammelt. Zu diesem Volumen gibt man dann auch noch die Hälfte des Volumens von 9M LiCl (Lithiumchlorid) hinzu -> 50µl Hepes/Urea, 25µl LiCl. Das war für uns am Donnerstag dann auch erst mal der letzte Schritt. Die Eppis kamen schön über Nacht bei 4° C in den Kühlschrank und blieben bis zu weiteren Schritten am nächsten Tag dort drinnen.
6. Neuer Tag – Freitag Vormittag. Und schon geht’s wieder weiter mit unserer RNA-Isolation. Netterweise hatte Helene bereits unsere Eppis in die Zentrifuge gestellt und bei 4° C eingestellt. Der Überstand wird wieder heraus pipettiert, ohne die Pellets zu entfernen. Der Blick ist mittlerweile auch schon etwas geschärfter und die Pellets sichtbar. Die Größen sind jedoch unterschiedlich groß. Wieder kommt 1ml Ethanol hinzu (gleich wie gestern 75%iger), zentrifugiert bei 4° C für 5 Min und der Überstand dann wieder abpipettiert. Das ganze wird 1x wiederholt und danach spinnt man den übrigen Ethanol ab und trocknet alles an der Luft bis das Pellet allein übrig bleibt. Der Rest wird mit Wasser im Eppi aufgefüllt. Dabei sind die Mengen nicht identisch sondern halten sich an die Größe der Pellets. Die Mengen gehen auseinander von 22µl bis 30 µl.
Weil der Arbeitstag fürs erste vorbei war, gings mit den Eppis aufs Eis, in dem sie übers Wochenende bleiben sollte. Dort fühlen sie sich genau wohl. Gut wenn sis bis zum Montag schaffen. Gut nun hatten wir auch noch unsere Zellen um die wir uns kümmern mussten. Denn die hatten ihr Nährmedium bereits fast verspeist und brauchten einen Wechsel. Das erledigten wir unter Markus‘ Aufsicht auch anstandslos. Nun war die Flüssigkeit in unseren Fläschchen wieder schön tiefrot und die Hautzellen sollten bis zum Montag wohl hoffentlich nicht verhungern. Zurück im Inkubator (37° C) verließen wir unsere Schützlinge dann auch; Zuversichtlich dass sie gut versorgt waren. Am Montag geht’s ans spalten um ihnen wieder mehr Platz zu lassen, denn vermehren tun sie sich unheimlich schnell.
