Tag 11 - aus RNA wird cDNA und unsere Zellen haben wieder Platz
18:13 / 27.07.2010
Montag, Montag. Der letzte Montag meines Praktikums. Die Zeit vergeht einfach viel zu schnell und bald ists schon wieder vorbei…
Sohoo nun waren wir also bei der cDNA Synthese angekommen. Die RNA wollten wir in cDNA umwandeln weil diese resistenter und weniger anfällig für Verunreinigungen ist. RNAsen, der größte Feind unserer RNA ist in der Umwelt häufig vorhanden – viel häufiger als die für die DNA schädlichen DNAsen. Für unser PCR Programm wollten wir also jetzt DNA, cDNa um genau zu sein. Das machten wir so:
Von unserer RNA nahmen wir 2 -4 µl und gaben sie in neue Eppis. Den genauen Betrag hatten wir uns vorher errechnet. Es kam ganz auf die Konzentration der RNA an. Den Rest füllten wir mit Wasser auf um auf ein Gesamtvolumen von 18,5 µl zu kommen. Außerdem kam in unsere 7 Eppis auch noch jeweils 1 µl oligo dT23AGC primer hinzu. Das alles kam in die PCR (Name: SEXY1) und blieb dort für 7 Minuten bei 68° C.
Unseren vorher vorbereiteten Enzymmix gaben wir danach hinzu. Er bestand aus: 6 µl 5x buffer, 3 µl 0,1M DTT, 1 µl dNTPs (Nukleotide) und 0,5 µl Superscript. Zusammen machten wir einen Mastermix für gleich all unsere Eppis. Die PCR kühlte vorher aber noch auf 25° C herab. (Im Programm machte man hier einfach eine Pause eben für diese Enzymbeigabe. Nun lief das Programm noch für weitere 80 min bei 42° C. Wir machten in der Zwischenzeit mal Mittagspause.
Für die Hydrolyse gaben wir nachher noch 10 µl 0,1 M NaOH hinzu und noch mal gings für 10 min und 70° C in die PCR. Für die Neutralisation zu NaCl gaben wir dann noch weitere 10 µl 0,1M HCl hinzu und genau so beließen wir unsere Eppis. Für weitere Verwendung waren sie nun geeignet.
Aber gehen wir doch zwischendurch mal ganz woanders hin. Nämlich in die Zellkultur und zu unseren schönen Hautzellen. Die wurden gestern mal gespalten. Es wurde ihnen schließlich in dem kleinen Fläschchen schon etwas eng und wir wollten wieder Platz zum weiter ausbreiten schaffen. Dabei half uns Markus. Er sagte uns wie wir das alte Medium absaugen mussten, dann in die Flaschen ein wenig BBS damit sich die Zellen vom Boden lösen – man sah unterm Mikroskop und sogar mit freiem Auge wie sich so schleimige Klumpen lösten und herumschwammen. Als alles unten war konnten dann ein Enzym (3,5 ml) und das neue Medium hinzugefügt werden. Dazu wurde mit der Pipette alles ein wenig auf und ab pipettiert um alles schön zu vermischen. Meine Zellen sind nun in einem Verhältnis von 3:5 in der neuen Flasche und Connys 1:5. Meine sollte also schneller wieder voll bewachsen sein. Mal sehen, was die nächsten Tage so bringen. Bin schon mal gespannt.
Sohoo nun waren wir also bei der cDNA Synthese angekommen. Die RNA wollten wir in cDNA umwandeln weil diese resistenter und weniger anfällig für Verunreinigungen ist. RNAsen, der größte Feind unserer RNA ist in der Umwelt häufig vorhanden – viel häufiger als die für die DNA schädlichen DNAsen. Für unser PCR Programm wollten wir also jetzt DNA, cDNa um genau zu sein. Das machten wir so:
Von unserer RNA nahmen wir 2 -4 µl und gaben sie in neue Eppis. Den genauen Betrag hatten wir uns vorher errechnet. Es kam ganz auf die Konzentration der RNA an. Den Rest füllten wir mit Wasser auf um auf ein Gesamtvolumen von 18,5 µl zu kommen. Außerdem kam in unsere 7 Eppis auch noch jeweils 1 µl oligo dT23AGC primer hinzu. Das alles kam in die PCR (Name: SEXY1) und blieb dort für 7 Minuten bei 68° C.
Unseren vorher vorbereiteten Enzymmix gaben wir danach hinzu. Er bestand aus: 6 µl 5x buffer, 3 µl 0,1M DTT, 1 µl dNTPs (Nukleotide) und 0,5 µl Superscript. Zusammen machten wir einen Mastermix für gleich all unsere Eppis. Die PCR kühlte vorher aber noch auf 25° C herab. (Im Programm machte man hier einfach eine Pause eben für diese Enzymbeigabe. Nun lief das Programm noch für weitere 80 min bei 42° C. Wir machten in der Zwischenzeit mal Mittagspause.
Für die Hydrolyse gaben wir nachher noch 10 µl 0,1 M NaOH hinzu und noch mal gings für 10 min und 70° C in die PCR. Für die Neutralisation zu NaCl gaben wir dann noch weitere 10 µl 0,1M HCl hinzu und genau so beließen wir unsere Eppis. Für weitere Verwendung waren sie nun geeignet.
Aber gehen wir doch zwischendurch mal ganz woanders hin. Nämlich in die Zellkultur und zu unseren schönen Hautzellen. Die wurden gestern mal gespalten. Es wurde ihnen schließlich in dem kleinen Fläschchen schon etwas eng und wir wollten wieder Platz zum weiter ausbreiten schaffen. Dabei half uns Markus. Er sagte uns wie wir das alte Medium absaugen mussten, dann in die Flaschen ein wenig BBS damit sich die Zellen vom Boden lösen – man sah unterm Mikroskop und sogar mit freiem Auge wie sich so schleimige Klumpen lösten und herumschwammen. Als alles unten war konnten dann ein Enzym (3,5 ml) und das neue Medium hinzugefügt werden. Dazu wurde mit der Pipette alles ein wenig auf und ab pipettiert um alles schön zu vermischen. Meine Zellen sind nun in einem Verhältnis von 3:5 in der neuen Flasche und Connys 1:5. Meine sollte also schneller wieder voll bewachsen sein. Mal sehen, was die nächsten Tage so bringen. Bin schon mal gespannt.
