Heute habe ich mit Fau Witsch Baumgartner die letzten drei Wochen nocheinmal Revue passieren lassen. Wir haben über die verschiedenen Methoden gesprochen die ich erlernt habe, sowie über die unterschiedlichen Erbkrankheiten, die am Institut detektiert/diagnostiziert werden....
Ich habe die letzten drei Wochen sehr genossen und möchte mich auch an dieser Stelle für die Gastfreundschaft am Institut und die Möglichkeit das Praktikum überhaupt machen zu können, durch Gen-au, bedanken.

Heute habe ich eine Multiplex-PCR für AZF gemacht. Nach der Elektrophorese habe ich das Bild der Banden mit einem neuen High-Tech-Gerät gemacht. Beeindruckend! Außerdem habe ich alles für die Sequenzierung von Exon 4, 7 und 8 des DHCR7-Gens gemacht.(Hab vor zwei Tagen schon darüber berichtet). Die Produkte kamen heute noch auf die Sequenzierplatte und deshalb kann morgen schon ausgewertet werden.... Morgen ist übrigens mein letzter Tag. Die Zeit verging sehr schnell.....

Heute habe ich die PCR Produkte des zweiten Ansatzes (PreCR-Repair Kit) durchs Gel laufen lassen. Die großen Fragmente waren nicht da, d.h. sind nicht amplifiziert worden, die Kleineren waren allerdings zu sehen. Aus diesem Grund habe ich diese PCR-Produkte mit Exosap-It gereinigt und zum Sequenzieren vorbereitet. Auch die nicht behandelte DNA habe ich auf diese Art und Weise aufbereiete. Nach der Sequenzierung wird man erkennen können, ob/in wie fern die Sequenzen tatsächlich korrekt und in voller Länge ligiert worden sind. Man kann allerdings jetzt schon sagen, dass sich große Fragmente nicht reparieren lassen, dazu ist dieser Kit nicht geeignet.
Außerdem habe ich heute neuen 10-fach TBE-Puffer gemacht. Für 5 liter braucht man: 540g TRIS, 275g Borsäure und 46.5g EDTA. Diese Substanzen in 5liter A.d. augeflöst.... schon fertig!

Da sich bei der Auswertung der Bandenmuster (PreCR-Repair-Mix "Mini-Projekt") keine klare Verbesserung, d.h. Verlängerung der DNA-Stränge, ergeben hat, habe ich heute eine neue PCR-Serie gestartet, also einen neuen Ansatz ausprobiert. Dazu habe ich doppelt so viel DNA (10 statt 5 mycroliter) für den PreCR Ansatz verwendet. Ich hoffe, dass sich morgen bei der Auswertung ein besseres Ergebnis zeigen wird. Zudem habe ich PCRs angesetzt um Exon 4, 7 und 8 des "SLOS-Gens" (DHCR7) Sequenzieren zu können. Letzte Woche habe ich für die selben Patienten schon Exon 6 und 9 (hier liegen die häufigsten Mutationen) sequenziert. Allerdings konnten hier keine Mutationen entdeckt werden. Die beiden Patienten sollten heterozygot sein, da ihr Kind (bereits verstorben) wahrscheinlich SLOS hatte. Dies gilt es hier zu bestätigen. Vielleicht sind die Beiden aber auch gar keine Träger...

Heute habe ich weiter an meinem Projekt gearbeitet. Ich habe 4 verschiedene PCRs mit verschiedenen Primern, für verschieden lange Sequenzen (von 100 bp bis 100bp) gemacht. Dazu habe ich einerseits die bereits mit dem PreCR-Repair Mix behandelte DNA und andererseits die Unbehandelte verwendet. Ziel des Ganzen sollte sein, festzustellen ob sich durch die Behandlung der DNA mit dem Kit längere DNA-Fragmente amplifizieren lassen, die somit dann im Agarosegel als "größere", also weniger weit gelaufene Banden sichtbar werden, als ohne Behandlung. Ergebnisse dann morgen...