Schon fast Routine?!?
13:32 / 22.07.2010
In den letzten 2 Tagen sind Abläufe vorgekommen, die ich im Prinzip schon letzte Woche beschrieben habe.
Zu allererst haben wir gestern die aufgeschlossenen Zellen eine Stunde lang zentrifugiert, um die Lipid Droplets vom Rest trennen zu können. Nach dem Zentrifugieren bildet sich eine weiße Schicht, die oben aufschwimmt, das sind die LDs. Damit die Probe der LDs rein(er) wird, haben wir Saccharose und Puffer B dazugegeben und wieder eine Stunde lang zentrifugiert. Diesen Vorgang nennt man auch „washing step“- die LDs werden gewaschen, damit die weiteren Arbeitsschritte bessere und genauere Ergebnisse liefern können.
Nach dem Waschen werden dann Proben der Lipid-Droplet-Fraktion genommen.
Gleich anschließend haben wir dann eine Protein- und eine Triglyceridbestimmung durchgeführt, die Ergebnisse waren zufriedenstellend: In den LDs fad sich mehr Triglycerid als irgendwo sonst, im Cytosol waren praktisch keine Triglyceride vorhanden. Die Proteinbestimmung zeigte, dass in der Membran, im Lysat und im Cytosol erwartungsgemäß viele, und in den LDs erwartungsgemäß wenige Proteine vorhanden sind.
Im Bezug auf die AML-12 Zellen, die ja infiziert sind, haben wir gestern etwas nicht Unbedeutendes herausgefunden: Es sind eigentlich keine AML-12 Zellen!^^
Da ist beim Auftauen der Zellen (für die Zellkultur werden sie gefroren geliefert und bei Bedarf aufgetaut) wohl ein Fehler passiert. Allerdings hat uns Renate die richtigen Zellen aufgetaut und wir hoffen, dass wir bald mit ihnen arbeiten können.
Außerdem haben wir gestern noch mal eine Mikroskopie der mit Ölsäure und Retinol beladenen Zellen gemacht. Der Vorteil diesmal war, dass die Zellen nicht so dicht waren und wir deshalb mehr erkennen konnten als beim letzten Mal.
Heute Früh haben wir die Bestimmungen von gestern ausgewertet (Ergebnisse siehe oben) und dann mit der HPLC-Vorbereitung begonnen, also die Proben gleich wie letzte Woche präpariert. Nur dass wir diesmal nur die Hälfte an LDs einsetzen und das beim Auswerten berücksichtigen, damit wir nicht so viel Material brauchen. Außerdem haben wir beim Retinolstock mehr verschiedene Verdünnungen, nämlich 0,1µM; 0,5µM; 1µM und 5µM.
Im Moment läuft die HPLC noch, deshalb habe ich auch schon jetzt Zeit, zu schreiben.
Für den heutigen Nachmittag haben wir noch folgendes vor:
1) HSC-Zellen: 1:2, das heißt aus drei Flaschen werden sechs.
2) HPLC: Ergebnisse dokumentieren, Auswertung folgt morgen.
3) AML-12 Zellen: Medium tauschen
Zu allererst haben wir gestern die aufgeschlossenen Zellen eine Stunde lang zentrifugiert, um die Lipid Droplets vom Rest trennen zu können. Nach dem Zentrifugieren bildet sich eine weiße Schicht, die oben aufschwimmt, das sind die LDs. Damit die Probe der LDs rein(er) wird, haben wir Saccharose und Puffer B dazugegeben und wieder eine Stunde lang zentrifugiert. Diesen Vorgang nennt man auch „washing step“- die LDs werden gewaschen, damit die weiteren Arbeitsschritte bessere und genauere Ergebnisse liefern können.
Nach dem Waschen werden dann Proben der Lipid-Droplet-Fraktion genommen.
Gleich anschließend haben wir dann eine Protein- und eine Triglyceridbestimmung durchgeführt, die Ergebnisse waren zufriedenstellend: In den LDs fad sich mehr Triglycerid als irgendwo sonst, im Cytosol waren praktisch keine Triglyceride vorhanden. Die Proteinbestimmung zeigte, dass in der Membran, im Lysat und im Cytosol erwartungsgemäß viele, und in den LDs erwartungsgemäß wenige Proteine vorhanden sind.
Im Bezug auf die AML-12 Zellen, die ja infiziert sind, haben wir gestern etwas nicht Unbedeutendes herausgefunden: Es sind eigentlich keine AML-12 Zellen!^^
Da ist beim Auftauen der Zellen (für die Zellkultur werden sie gefroren geliefert und bei Bedarf aufgetaut) wohl ein Fehler passiert. Allerdings hat uns Renate die richtigen Zellen aufgetaut und wir hoffen, dass wir bald mit ihnen arbeiten können.
Außerdem haben wir gestern noch mal eine Mikroskopie der mit Ölsäure und Retinol beladenen Zellen gemacht. Der Vorteil diesmal war, dass die Zellen nicht so dicht waren und wir deshalb mehr erkennen konnten als beim letzten Mal.
Heute Früh haben wir die Bestimmungen von gestern ausgewertet (Ergebnisse siehe oben) und dann mit der HPLC-Vorbereitung begonnen, also die Proben gleich wie letzte Woche präpariert. Nur dass wir diesmal nur die Hälfte an LDs einsetzen und das beim Auswerten berücksichtigen, damit wir nicht so viel Material brauchen. Außerdem haben wir beim Retinolstock mehr verschiedene Verdünnungen, nämlich 0,1µM; 0,5µM; 1µM und 5µM.
Im Moment läuft die HPLC noch, deshalb habe ich auch schon jetzt Zeit, zu schreiben.
Für den heutigen Nachmittag haben wir noch folgendes vor:
1) HSC-Zellen: 1:2, das heißt aus drei Flaschen werden sechs.
2) HPLC: Ergebnisse dokumentieren, Auswertung folgt morgen.
3) AML-12 Zellen: Medium tauschen
